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[求助]
95KD蛋白純化求助！�。。。。。。�
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本人做了一個95KD的聚合酶蛋白，表達量蠻小，純化過程中遇到了困難。分別用了20mM、50mM和250mM的咪唑溶液進行洗脫，發(fā)現(xiàn)在20和50mM低濃度洗脫時候，雜蛋白洗下來很少，250mM咪唑卻把大量目的蛋白和雜蛋白一起洗脫下來了，給純化造成了極大的困難。小弟想請教下各位大俠有什么高招給解決下。 SDS圖譜 |
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【答案】應助回帖
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若魚@@: 金幣+1, ★★★很有幫助 2012-05-23 09:09:52
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建議你先用Imidazole拉個線性試試，最佳濃度能洗下雜蛋白。再用階梯去洗。不過這只是摸條件用，這樣目的蛋白損失會很大。最好的是階梯洗脫。 對于你這張蛋白膠，不知道你洗雜的量。 我看50mM時候你的目的蛋白就已經開始下來了，而后面你直接跳到250mM去elute了，我個人覺得很不妥。 我給你個方案試試：先在50mM之前用低濃度Imidazole，比如30mM或者40mM大量洗洗，5ml柱子建議至少洗200ml。因為你膠上看20mM已經很好的除雜了。其次，50mM到250mM之間多設幾個階梯試試，75mM，100mM，150mM，200mM都要試試，見峰收就行。這樣保證會有一個濃度下目的蛋白會很多。通過這些步驟最后的250mM洗下的就可要可不要了。 這樣選擇純一點去過Q或者S，或者HP就能進一步純化了。 希望能幫到你。可以互相交流。 |
3樓2012-05-22 17:51:58
lihuan0525
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