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若魚(yú)@@新蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
95KD蛋白純化求助！�。。。。。。�
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本人做了一個(gè)95KD的聚合酶蛋白，表達(dá)量蠻小，純化過(guò)程中遇到了困難。分別用了20mM、50mM和250mM的咪唑溶液進(jìn)行洗脫，發(fā)現(xiàn)在20和50mM低濃度洗脫時(shí)候，雜蛋白洗下來(lái)很少，250mM咪唑卻把大量目的蛋白和雜蛋白一起洗脫下來(lái)了，給純化造成了極大的困難。小弟想請(qǐng)教下各位大俠有什么高招給解決下。 SDS圖譜 |
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【答案】應(yīng)助回帖
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silicare: 金幣+6, BioEPI+1, 應(yīng)助指數(shù)+1, 有道理 2012-05-22 18:00:54
若魚(yú)@@: 金幣+1, ★★★很有幫助 2012-05-23 09:09:52
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若魚(yú)@@: 金幣+1, ★★★很有幫助 2012-05-23 09:09:52
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建議你先用Imidazole拉個(gè)線性試試，最佳濃度能洗下雜蛋白。再用階梯去洗。不過(guò)這只是摸條件用，這樣目的蛋白損失會(huì)很大。最好的是階梯洗脫。 對(duì)于你這張蛋白膠，不知道你洗雜的量。 我看50mM時(shí)候你的目的蛋白就已經(jīng)開(kāi)始下來(lái)了，而后面你直接跳到250mM去elute了，我個(gè)人覺(jué)得很不妥。 我給你個(gè)方案試試：先在50mM之前用低濃度Imidazole，比如30mM或者40mM大量洗洗，5ml柱子建議至少洗200ml。因?yàn)槟隳z上看20mM已經(jīng)很好的除雜了。其次，50mM到250mM之間多設(shè)幾個(gè)階梯試試，75mM，100mM，150mM，200mM都要試試，見(jiàn)峰收就行。這樣保證會(huì)有一個(gè)濃度下目的蛋白會(huì)很多。通過(guò)這些步驟最后的250mM洗下的就可要可不要了。 這樣選擇純一點(diǎn)去過(guò)Q或者S，或者HP就能進(jìn)一步純化了。 希望能幫到你。可以互相交流。 |
3樓2012-05-22 17:51:58
lihuan0525
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