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wshi85

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[求助] 一個(gè)簡單實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)

懦懦的問下：我想做一個(gè)酶的基因的測序，是不是可以先提取總的RNA,之后是否可以直接就將總的rna進(jìn)行cDNA合成（需不需要進(jìn)行mRNA進(jìn)行提取？）,在設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增mRNA的基因？本人還未涉足這些實(shí)驗(yàn)，但是馬上要做了，所以請(qǐng)教大家

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1樓 2012-05-22 16:56:08

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crazymouse66

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【答案】應(yīng)助回帖

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amisking: 金幣+4, 鼓勵(lì)發(fā)帖幫助解答問題。 2012-05-22 19:29:35
wshi85: 金幣+2, ★★★很有幫助 2012-05-24 08:40:02

先提取總RNA，然后利用通用引物反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR后電泳，觀察在相應(yīng)的mark處是否有條帶出現(xiàn)，有的話切膠回收DNA，然后與載體進(jìn)行連接，然后導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞，一晚后挑菌落進(jìn)行培養(yǎng)，再做菌液PCR看是否是你要的條帶，是的話連著菌液送出去測序就可以了。（不用進(jìn)行mRNA提�。�

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2樓2012-05-22 19:22:49

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yingyifei

銀蟲 (初入文壇)

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【答案】應(yīng)助回帖

★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2012-05-23 13:58:26
wshi85: 金幣+1, ★★★很有幫助 2012-05-24 08:40:08

mRNA的量一般比較少，直接用通用引物反轉(zhuǎn)錄，rRNA會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生較大的影響，我覺得應(yīng)該提出mRNA然后再反轉(zhuǎn)錄成cDNA。不過，如果tRNA的量可以達(dá)到一定的量，直接設(shè)計(jì)引物反轉(zhuǎn)錄也可以，用引物PCR可以特異性的擴(kuò)增出需要的產(chǎn)物，然后再進(jìn)行接下來的實(shí)驗(yàn)

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ying

3樓2012-05-22 23:51:58

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atlanticwi

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【答案】應(yīng)助回帖

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小丹木木: 金幣+3, 哇，很熱心哦 2012-05-23 13:58:46
wshi85: 金幣+5, ★★★★★最佳答案 2012-05-24 08:39:33
西瓜: 金幣+2, Good！ 2012-05-27 12:51:19
西瓜: MolEPI+1, 補(bǔ)上 2012-05-27 12:51:33

嗯...........................
   不明白樓上各位的通用引物指的是什么................
   具體流程應(yīng)該如下：
   1. 提取樣品Total RNA
   2. 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 肯定使用OligodT做引物這樣保證反轉(zhuǎn)的是mRNA 同時(shí)若你的基因超過2000bp以上很可能因?yàn)榉崔D(zhuǎn)錄酶效率問題而造成無法合成全長這樣的話最好使用高質(zhì)量Reverse Transcriptase 諸如SuperScript系列同時(shí)輔以O(shè)ligodT+Random Hexamer作為引物的方式才能夠得到全長cDNA
   3. 設(shè)計(jì)需要你PCR基因全長的引物不同的克隆策略需要設(shè)計(jì)不同的5'側(cè)翼附加序列引物此地方假設(shè)你只需要測序（采取TA克隆策略）結(jié)果引物擴(kuò)增結(jié)果只要有ATG到終止密碼子就可以了
   4. PCR你的cDNA（最好P前稀釋你的cDNA 過量的cDNA模板會(huì)影響PCR效率建議稀釋2到5倍）得到正確條帶后膠回收產(chǎn)物
   5. 進(jìn)行+A Tail反應(yīng) （假設(shè)你用的是高保真酶系列）后進(jìn)行乙醇沉淀DNA（選做不做的話假陽性高但是不費(fèi)這步力氣）
   6. 連接T載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞涂正確的抗性板
   7. 第二天挑選單菌落做鑒定進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng) 可以提質(zhì)粒或直接菌液測序
   ....................................
   個(gè)人看法若有說錯(cuò)請(qǐng)高手指點(diǎn)

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4樓2012-05-23 00:44:52

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引用回帖:

4樓: Originally posted by atlanticwi at 2012-05-23 00:44:52:
嗯...........................
   不明白樓上各位的通用引物指的是什么................
   具體流程應(yīng)該如下：
   1. 提取樣品Total RNA
   2. 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 肯定使用OligodT做引物這樣保證反

嗯，那我想問下逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)我打算買上海生工的試劑盒做，那是不是不需要在買“Reverse Transcriptase 諸如SuperScript系列同時(shí)輔以O(shè)ligodT+Random Hexamer”，猜測mRNA大概在2000bp左右

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5樓2012-05-23 16:42:10

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2樓: Originally posted by crazymouse66 at 2012-05-22 19:22:49:
先提取總RNA，然后利用通用引物反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR后電泳，觀察在相應(yīng)的mark處是否有條帶出現(xiàn)，有的話切膠回收DNA，然后與載體進(jìn)行連接，然后導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞，一晚后挑菌落進(jìn)行培養(yǎng)，再做菌液PCR看

我打算買試劑盒做cDNA,這個(gè)通用的引物就是指試劑盒附帶的引物嗎？還有做PCR時(shí)的mark是什么？需要自己在買的嗎（pcr也打算買試劑盒）

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6樓2012-05-23 16:45:05

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atlanticwi

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引用回帖:

5樓: Originally posted by wshi85 at 2012-05-23 16:42:10:
嗯，那我想問下逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)我打算買上海生工的試劑盒做，那是不是不需要在買“Reverse Transcriptase 諸如SuperScript系列同時(shí)輔以O(shè)ligodT+Random Hexamer”，猜測mRNA大概在2000bp左右

嗯..............................
沒有必要試劑盒的東西最好不要亂換 2000bp左右使用盒子自帶RTase就夠了 OligodT+Random Hexamer做引物也可以這種長度的片段單單使用OligodT也是可以做出來的看你自己選擇了

我前邊說的那些都不是拿試劑盒的來做的。

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7樓2012-05-23 18:47:47

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孫啟亮

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牛啊，一個(gè)植物生理生化專業(yè)的專家讓我們這些做分子微生物的情何以堪

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8樓2012-05-23 20:01:57

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sayaya

9樓2012-05-24 08:30:13

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damaomao

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10樓2012-05-25 11:36:21

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