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wshi85木蟲 (正式寫手)
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[求助]
一個(gè)簡(jiǎn)單實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)
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| 懦懦的問下：我想做一個(gè)酶的基因的測(cè)序，是不是可以先提取總的RNA,之后是否可以直接就將總的rna進(jìn)行cDNA合成（需不需要進(jìn)行mRNA進(jìn)行提�。浚�,在設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增mRNA的基因？本人還未涉足這些實(shí)驗(yàn)，但是馬上要做了，所以請(qǐng)教大家 |
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atlanticwi
金蟲 (正式寫手)
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嗯........................... 不明白樓上各位的通用引物指的是什么................ 具體流程應(yīng)該如下： 1. 提取樣品Total RNA 2. 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 肯定使用OligodT做引物 這樣保證反轉(zhuǎn)的是mRNA 同時(shí)若你的基因超過2000bp以上 很可能因?yàn)榉崔D(zhuǎn)錄酶效率問題而造成無法合成全長(zhǎng) 這樣的話 最好使用高質(zhì)量Reverse Transcriptase 諸如SuperScript系列 同時(shí)輔以O(shè)ligodT+Random Hexamer作為引物的方式才能夠得到全長(zhǎng)cDNA 3. 設(shè)計(jì)需要你PCR基因全長(zhǎng)的引物 不同的克隆策略需要設(shè)計(jì)不同的5'側(cè)翼附加序列引物 此地方假設(shè)你只需要測(cè)序（采取TA克隆策略）結(jié)果引物擴(kuò)增結(jié)果只要有ATG到終止密碼子就可以了 4. PCR你的cDNA（最好P前稀釋你的cDNA 過量的cDNA模板會(huì)影響PCR效率 建議稀釋2到5倍）得到正確條帶后 膠回收產(chǎn)物 5. 進(jìn)行+A Tail反應(yīng) （假設(shè)你用的是高保真酶系列）后進(jìn)行乙醇沉淀DNA（選做 不做的話假陽性高 但是不費(fèi)這步力氣） 6. 連接T載體 轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞 涂正確的抗性板 7. 第二天挑選單菌落做鑒定 進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng) 可以提質(zhì)粒或直接菌液測(cè)序 .................................... 個(gè)人看法 若有說錯(cuò)請(qǐng)高手指點(diǎn)  |
4樓2012-05-23 00:44:52
crazymouse66
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| 先提取總RNA，然后利用通用引物反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR后電泳，觀察在相應(yīng)的mark處是否有條帶出現(xiàn)，有的話切膠回收DNA，然后與載體進(jìn)行連接，然后導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞，一晚后挑菌落進(jìn)行培養(yǎng)，再做菌液PCR看是否是你要的條帶，是的話連著菌液送出去測(cè)序就可以了。（不用進(jìn)行mRNA提取） |
2樓2012-05-22 19:22:49
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| mRNA的量一般比較少，直接用通用引物反轉(zhuǎn)錄，rRNA會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生較大的影響，我覺得應(yīng)該提出mRNA然后再反轉(zhuǎn)錄成cDNA。不過，如果tRNA的量可以達(dá)到一定的量，直接設(shè)計(jì)引物反轉(zhuǎn)錄也可以，用引物PCR可以特異性的擴(kuò)增出需要的產(chǎn)物，然后再進(jìn)行接下來的實(shí)驗(yàn) |
3樓2012-05-22 23:51:58
wshi85
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5樓2012-05-23 16:42:10
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