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kabuqinuo89新蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
測(cè)序后證明克隆出非目的基因
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我要做原核表達(dá)。 實(shí)驗(yàn)一開(kāi)始是很順利的，PCR得到目的基因片段（1000bp左右），回收，連接T載體，轉(zhuǎn)化，最后提質(zhì)粒，做酶切和PCR鑒定，都和目的片段相吻合，電泳跑出的條帶也很不錯(cuò)。 可測(cè)序結(jié)果與我的參考序列一比對(duì)，完全不是目的片段，查找引物時(shí),也只找到下游引物。 這足以說(shuō)明我做出的東西完全不是我需要的。 我想是不是我的引物特異性不好？這對(duì)引物是從一篇文章中直接引用的。于是又用oligo分析了一下我的引物，各項(xiàng)指標(biāo)都還可以，應(yīng)該特異性很高的。實(shí)驗(yàn)中采用的退火溫度也是完全按oligo的建議溫度。 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行到這一步，我不知從什么地方找原因了。究竟哪會(huì)出問(wèn)題呢？這是己經(jīng)有人做過(guò)的，并且做出來(lái)了，有文章可查（國(guó)外的），為什么我做不出來(lái)呢？ 下一步該怎么做，是不是需要從頭再來(lái)，哪些地方要做什么樣的調(diào)整？心里真是沒(méi)譜兒…… 請(qǐng)各位老師幫幫我，在此先謝過(guò)了。 |
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atlanticwi
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【答案】應(yīng)助回帖
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小丹木木: 金幣+2, 呵呵，鼓勵(lì)交流哦。順便說(shuō)一下，第一個(gè)貓貓也是我最喜歡的。 2012-05-23 13:56:12
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嗯..................... 我覺(jué)得要是做驗(yàn)證的時(shí)候 不僅要做PCR還要酶切一下看看 這樣才可靠 引物問(wèn)題最好設(shè)計(jì)前BLAST一下 看有沒(méi)有不同種之間的非特異擴(kuò)增 這種事幾率很小 但遇到了只能讓人哭 前些日子 本實(shí)驗(yàn)?zāi)橙司陀龅侥氵@種情況 測(cè)序結(jié)果再BLAST發(fā)現(xiàn)東西是人皮膚上的某種蛋白.............老板臉色很難看 不注意預(yù)防污染就淚奔了  遇到這種情況 只能從頭來(lái)了 還是預(yù)祝孩子實(shí)驗(yàn)順利吧 沒(méi)有搞不定的實(shí)驗(yàn)的  |
2樓2012-05-22 22:58:30
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