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[交流]
電泳圖譜咋這個(gè)樣子，求助啊！
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發(fā)覺(jué)自己的DNA電泳譜圖老是很分得不好，有時(shí)候有很?chē)?yán)重的拖尾現(xiàn)象。上次看到樓上實(shí)驗(yàn)室的師姐做得就非常清晰，每個(gè)band都分得很開(kāi)，而且沒(méi)有拖尾。我一般做電泳的條件是： 1.電壓為80mV， 2.電泳時(shí)間一般為25－30min 3.一般吸取5ul待測(cè)DNA懸液，加到1ul loading buffer上混勻，然后加入well. 感覺(jué)條帶總是不好，用的是Bio-rad的凝膠成像儀。 我最近做的一張圖譜再附件里。 想請(qǐng)問(wèn)各位前輩： 1.電泳電壓對(duì)band的清晰度和分辨率影響有多大？ 2.loading buffer的加量要遵守什么哪些條件，是不是有比例的？ 3.怎么才能讓電泳圖看上去好些呢？ |
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2樓2007-04-21 11:12:49
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3樓2007-04-21 11:15:28
lys6827
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4樓2007-04-21 11:55:08
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dfggc(金幣+2):多謝交流
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1 由于DNA分子量很大，一般建議用0.5-0.8%膠來(lái)電泳。PCR產(chǎn)物基本上可以根據(jù)分子量來(lái)決定膠濃度，一般用1-1.5%的膠濃度。所以建議，你用兩塊膠分別來(lái)跑DNA和PCR產(chǎn)物。 2 電泳電壓對(duì)band的清晰度和分辨率是由影響的，電壓的大小取決于你用的電泳槽正負(fù)極間的距離，一般是3-5V/cm。電壓過(guò)高或過(guò)低，對(duì)band的清晰度和分辨率都是有影響的。 3 loading buffer的加量，要取決于你用的是幾乘的loading buffer，如果是6Xloading buffer，loading buffer的量為你點(diǎn)樣量的1/6，那么如果你點(diǎn)樣5-6ul，加1ul loading buffer是可以的。如果用的是10Xloading buffer，loading buffer的量為你點(diǎn)樣量的1/10，即如果你點(diǎn)樣5ul，加0.5ul loading buffer就可以了。但是一般情況下，loading buffer量的多少對(duì)于條帶的清晰與美觀并無(wú)太大關(guān)系。 4 我們lab用的也是BIO-RAD的凝膠成像系統(tǒng)，說(shuō)實(shí)話，你的條帶是不太清晰。 建議A你用制膠的梳子時(shí)選擇梳子空扁長(zhǎng)的，那么條帶會(huì)好看些。膠濃度也要相應(yīng)調(diào)整。 B因?yàn)槟愕腗ARKER也不大漂亮，建議電壓要優(yōu)化些，電泳時(shí)間要視溴酚蘭位于凝膠2/3位置時(shí)，可以停止電壓。 C 還有你的電泳緩沖液，無(wú)論是TBE或是TAE，建議你換新的來(lái)電泳。一步步排除問(wèn)題。 最后，祝你好運(yùn)！呵呵 |
5樓2007-04-21 12:39:07
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1 由于DNA分子量很大，一般建議用0.5-0.8%膠來(lái)電泳。PCR產(chǎn)物基本上可以根據(jù)分子量來(lái)決定膠濃度，一般用1-1.5%的膠濃度。所以建議，你用兩塊膠分別來(lái)跑DNA和PCR產(chǎn)物。 2 電泳電壓對(duì)band的清晰度和分辨率是由影響的，電壓的大小取決于你用的電泳槽正負(fù)極間的距離，一般是3-5V/cm。電壓過(guò)高或過(guò)低，對(duì)band的清晰度和分辨率都是有影響的。 3 loading buffer的加量，要取決于你用的是幾乘的loading buffer，如果是6Xloading buffer，loading buffer的量為你點(diǎn)樣量的1/6，那么如果你點(diǎn)樣5-6ul，加1ul loading buffer是可以的。如果用的是10Xloading buffer，loading buffer的量為你點(diǎn)樣量的1/10，即如果你點(diǎn)樣5ul，加0.5ul loading buffer就可以了。但是一般情況下，loading buffer量的多少對(duì)于條帶的清晰與美觀并無(wú)太大關(guān)系。 4 我們lab用的也是BIO-RAD的凝膠成像系統(tǒng)，說(shuō)實(shí)話，你的條帶是不太清晰。 建議A你用制膠的梳子時(shí)選擇梳子空扁長(zhǎng)的，那么條帶會(huì)好看些。膠濃度也要相應(yīng)調(diào)整。 B因?yàn)槟愕腗ARKER也不大漂亮，建議電壓要優(yōu)化些，電泳時(shí)間要視溴酚蘭位于凝膠2/3位置時(shí)，可以停止電壓。 C 還有你的電泳緩沖液，無(wú)論是TBE或是TAE，建議你換新的來(lái)電泳。一步步排除問(wèn)題。 最后，祝你好運(yùn)！呵呵 |
6樓2007-04-21 12:41:39
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7樓2007-04-21 18:49:17
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8樓2007-04-21 20:29:09
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9樓2007-04-22 00:52:41
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