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jixiao_02銅蟲 (小有名氣)
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[求助]
希望高人指點迷津，關(guān)于蛋白質(zhì)葡聚糖凝膠過柱問題
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我過凝膠柱過了好幾遍了，用的是G-25葡聚糖凝膠柱，蛋白質(zhì)應(yīng)該先被洗脫下來，可是我每次過柱子，用280nm下測蛋白質(zhì)吸光度，可是測出的結(jié)果是蛋白質(zhì)在后邊洗脫下來，而且沒有明顯的差別，洗脫的每一瓶里都有一定量的蛋白質(zhì)，我是不是過柱子時出現(xiàn)了什么問題，或者裝柱子時出現(xiàn)了問題，問什么結(jié)果會這樣？希望有高人指點一下，我現(xiàn)在是極度的需要解答！ 最近看了一些信息，凝膠必須經(jīng)過脫氣處理，否則柱效會很差，我沒有經(jīng)過脫氣處理，溶脹之后直接裝柱了，這個會對實驗結(jié)果有什么影響��？ [ Last edited by jixiao_02 on 2012-5-29 at 11:07 ] |
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jixiao_02
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據(jù)我個人看，你這有幾方面問題，你去逐一檢查。 首先，柱子有個分離的范圍，分子量越大，越好分離。反而分子量小的，可能會和小分子一起下來。同時上樣體積盡量小，在濃縮時候不沉淀為準(zhǔn)。 其次，裝柱要壓實。同時如果你沒有脫氣處理的話，可以先用水沖洗至少1.2個柱體積再換上buffer，最后上樣。 最后，針對你出現(xiàn)的問題，洗脫中每一瓶都有蛋白，我覺得裝柱時候可能凝膠破損了，以至于蛋白從開始就一直流穿直到最后。 希望能幫到你。 |
2樓2012-05-29 12:29:59
lihuan0525
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第一，你應(yīng)該檢查一下，你的裝柱，裝膠后有沒有壓實，即用蠕動泵按照＞上樣洗脫流速進(jìn)行壓柱，將填料壓均勻。否則，柱效不好。 第二，你的樣品濃度是不是很��？上樣體積是不是過大？ 第三，至于溶脹，沒有很大的關(guān)系，一般用常溫純水即可，溶脹時間24h； 第四，裝膠的時候，一定不能分段添加，要將填料一次性添加進(jìn)去，然后用蠕動泵或其他的動力裝置用水壓實。 |
4樓2012-05-29 15:03:25
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