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北京石油化工學(xué)院2026年研究生招生接收調(diào)劑公告

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jixiao_02

銅蟲(chóng) (小有名氣)

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[求助] 希望高人指點(diǎn)迷津，關(guān)于蛋白質(zhì)葡聚糖凝膠過(guò)柱問(wèn)題

我過(guò)凝膠柱過(guò)了好幾遍了，用的是G-25葡聚糖凝膠柱，蛋白質(zhì)應(yīng)該先被洗脫下來(lái)，可是我每次過(guò)柱子，用280nm下測(cè)蛋白質(zhì)吸光度，可是測(cè)出的結(jié)果是蛋白質(zhì)在后邊洗脫下來(lái)，而且沒(méi)有明顯的差別，洗脫的每一瓶里都有一定量的蛋白質(zhì)，我是不是過(guò)柱子時(shí)出現(xiàn)了什么問(wèn)題，或者裝柱子時(shí)出現(xiàn)了問(wèn)題，問(wèn)什么結(jié)果會(huì)這樣？希望有高人指點(diǎn)一下，我現(xiàn)在是極度的需要解答！
最近看了一些信息，凝膠必須經(jīng)過(guò)脫氣處理，否則柱效會(huì)很差，我沒(méi)有經(jīng)過(guò)脫氣處理，溶脹之后直接裝柱了，這個(gè)會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有什么影響啊？

[ Last edited by jixiao_02 on 2012-5-29 at 11:07 ]

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1樓 2012-05-29 11:01:21

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dshlove

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amisking: 金幣+4, 鼓勵(lì)發(fā)帖幫助解答問(wèn)題。 2012-05-29 20:04:56

據(jù)我個(gè)人看，你這有幾方面問(wèn)題，你去逐一檢查。
首先，柱子有個(gè)分離的范圍，分子量越大，越好分離。反而分子量小的，可能會(huì)和小分子一起下來(lái)。同時(shí)上樣體積盡量小，在濃縮時(shí)候不沉淀為準(zhǔn)。
其次，裝柱要壓實(shí)。同時(shí)如果你沒(méi)有脫氣處理的話，可以先用水沖洗至少1.2個(gè)柱體積再換上buffer，最后上樣。
最后，針對(duì)你出現(xiàn)的問(wèn)題，洗脫中每一瓶都有蛋白，我覺(jué)得裝柱時(shí)候可能凝膠破損了，以至于蛋白從開(kāi)始就一直流穿直到最后。
希望能幫到你。

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2樓2012-05-29 12:29:59

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danbomingyue

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amisking: 金幣+3, BioEPI+1, 鼓勵(lì)發(fā)帖交流問(wèn)題。 2012-05-29 20:05:07

第一，你應(yīng)該檢查一下，你的裝柱，裝膠后有沒(méi)有壓實(shí)，即用蠕動(dòng)泵按照＞上樣洗脫流速進(jìn)行壓柱，將填料壓均勻。否則，柱效不好。
第二，你的樣品濃度是不是很��？上樣體積是不是過(guò)大？
第三，至于溶脹，沒(méi)有很大的關(guān)系，一般用常溫純水即可，溶脹時(shí)間24h；
第四，裝膠的時(shí)候，一定不能分段添加，要將填料一次性添加進(jìn)去，然后用蠕動(dòng)泵或其他的動(dòng)力裝置用水壓實(shí)。

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4樓2012-05-29 15:03:25

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dshlove

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8樓: Originally posted by jixiao_02 at 2012-05-29 16:28:42
謝謝，我裝凝膠的時(shí)候是沿著柱壁往下倒的，并且柱低有大約3cm的蒸餾水，這樣裝柱，凝膠會(huì)破碎嗎？并且我的蛋白質(zhì)是從動(dòng)物里提取的混合物，是未知蛋白質(zhì)，雖然每一瓶里都有蛋白質(zhì)，但是在8、9的蛋白質(zhì)吸收峰最高，這 ...

剛看你上面的回答了，柱子是要用泵去給壓力，壓實(shí)的，完全靠重力是不可能壓實(shí)的�，F(xiàn)在來(lái)看不是你凝膠破碎的問(wèn)題了，你這柱子中可能還有空隙的，雖然你肉眼是看不到的。所以你的蛋白可能會(huì)聚集在某處，而不是均勻的走下來(lái)，某時(shí)間還會(huì)一起沖下來(lái)。而且，我不建議你將凝膠反復(fù)烘干使用。

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9樓2012-05-29 16:34:36

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5樓: Originally posted by jixiao_02 at 2012-05-29 16:09:09
真的是非常感謝，但是我并沒(méi)有蠕動(dòng)泵，全靠重力的作用平衡柱子，怎樣的柱子才算是壓均勻了，這個(gè)不太懂唉，能不能再給說(shuō)詳細(xì)點(diǎn)。不好意思，我剛接觸這個(gè)實(shí)驗(yàn)，好多不太明白。還有就是我上樣的蛋白質(zhì)的濃度是20mg/m ...

G-25柱是一個(gè)組群分離的柱子，目的是將蛋白質(zhì)和小分子物質(zhì)進(jìn)行分離，主要被推薦用于含有球蛋白的組群分離。該柱料用于以分子量大于5000的分子中除鹽和其他小分子污染物。
你的蛋白濃度在20mg/ml應(yīng)該可以了。一般為了增加柱料的分辨能力，樣品要濃縮。但是要避免濃度高于70mg/ml，因?yàn)檎扯刃?yīng)會(huì)干擾分離。
對(duì)于上樣體積，要根據(jù)你柱子的柱體積而來(lái)。對(duì)于脫鹽柱而言，最高上樣量可達(dá)30%。

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13樓2012-05-30 08:44:01

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15樓: Originally posted by jixiao_02 at 2012-05-31 09:31:43
我過(guò)柱子除的是分子量390的分子，應(yīng)該是可以完全分來(lái)的，蛋白質(zhì)應(yīng)該在前邊基本上全部洗脫下來(lái)吧，但是不知道為什么，蛋白質(zhì)在每一管里都有，而后邊小分子和蛋白質(zhì)混合下來(lái)。有人建議我買(mǎi)一個(gè)蠕動(dòng)泵，說(shuō)用重力很難將 ...

如果每一個(gè)管中都有蛋白的話，那就是柱子柱效不好，裝柱沒(méi)裝好啊。你可以嘗試先看看裝柱注意事項(xiàng)，并重新裝柱。另外，建議你直接買(mǎi)GE lifesciences的PD-10柱，柱效絕對(duì)好，他們都是機(jī)器裝柱，很好用的，至于價(jià)錢(qián)我不是很清楚，目前實(shí)驗(yàn)室用的還是之前別人買(mǎi)的。

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16樓2012-05-31 10:16:58

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我有一份關(guān)于關(guān)于柱效測(cè)定和裝柱方法的資料，可以給樓主看看，忽然發(fā)現(xiàn)不知道怎么上傳資料

稍等。。。

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17樓2012-05-31 10:23:07

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jixiao_02: 金幣+1, ★★★很有幫助 2012-05-29 16:09:32

樓主是怎么溶脹的，是用熱水還是用的冷水，溶脹的時(shí)間多長(zhǎng)

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3樓2012-05-29 13:52:48

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jixiao_02

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4樓: Originally posted by danbomingyue at 2012-05-29 15:03:25
第一，你應(yīng)該檢查一下，你的裝柱，裝膠后有沒(méi)有壓實(shí)，即用蠕動(dòng)泵按照＞上樣洗脫流速進(jìn)行壓柱，將填料壓均勻。否則，柱效不好。
第二，你的樣品濃度是不是很��？上樣體積是不是過(guò)大？
第三，至于溶脹，沒(méi)有很大的關(guān) ...

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5樓2012-05-29 16:09:09

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3樓: Originally posted by lihuan0525 at 2012-05-29 13:52:48
樓主是怎么溶脹的，是用熱水還是用的冷水，溶脹的時(shí)間多長(zhǎng)

用的是熱水溶脹的，2小時(shí)

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6樓2012-05-29 16:19:10

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amisking: 回帖置頂 2012-05-29 20:05:13

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7樓2012-05-29 16:26:59

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2樓: Originally posted by dshlove at 2012-05-29 12:29:59
據(jù)我個(gè)人看，你這有幾方面問(wèn)題，你去逐一檢查。
首先，柱子有個(gè)分離的范圍，分子量越大，越好分離。反而分子量小的，可能會(huì)和小分子一起下來(lái)。同時(shí)上樣體積盡量小，在濃縮時(shí)候不沉淀為準(zhǔn)。
其次，裝柱要壓實(shí)。同時(shí) ...

謝謝，我裝凝膠的時(shí)候是沿著柱壁往下倒的，并且柱低有大約3cm的蒸餾水，這樣裝柱，凝膠會(huì)破碎嗎？并且我的蛋白質(zhì)是從動(dòng)物里提取的混合物，是未知蛋白質(zhì)，雖然每一瓶里都有蛋白質(zhì)，但是在8、9的蛋白質(zhì)吸收峰最高，這是為什么呢？還有就是我原來(lái)的凝膠柱子沖干凈之后，我會(huì)將凝膠卸下來(lái)烘干，磨成粉末，凝膠顆粒真的很脆弱嗎？這樣凝膠顆粒會(huì)破裂嗎？

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