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【答案】應(yīng)助回帖
熒光原位雜交（FISH）的實(shí)驗(yàn)步驟
FISH（Fluorescence In-Situ Hybridization）技術(shù)問世于20世紀(jì)70年代后期，是在原來的同位素原位雜交技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。其基本原理是，按照兩個(gè)核酸的堿基序列互 補(bǔ)原則，用特殊修飾的核苷酸分子標(biāo)記DNA探針，然后將標(biāo)記的探針直接原位雜交到染色體或DNA 纖維切片上，再與熒光素分子偶聯(lián)的單克隆抗體和探針分子特異性結(jié)合，經(jīng)熒光檢測系統(tǒng)和圖形分析技術(shù)對染色體或DNA纖維上的DNA序列定位、定性和相對定 量。試驗(yàn)方法如下：
1）玻片處理
（a）玻片清洗：熱肥皂水刷洗，1%鹽酸浸泡24h，再在0.1%焦炭酸二乙酯（DEPC）中浸泡24h。
（b）硅化處理：玻片和蓋玻片1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）鹽酸煮沸10min，烘干，錫紙包好4℃保存?zhèn)溆谩?br />
（c）明膠涂片制備：將烘干的玻片放入明膠中10min，然后60℃烘干過夜備用。
（d）試劑瓶、塑料器皿及組織勻漿器的處理試劑瓶、組織勻漿器先清洗干凈，用1 mL/LDEPC (Diethyl Pyrocarbonate)水溶液浸泡處理(37℃、2h，室溫過夜)，高壓消毒去除DEPC，然后250℃烘干4h以上或200℃過夜。稱量試劑勺也 要干烤。塑料器皿最好用滅菌的一次性塑料用品，使用前進(jìn)行高壓消毒，為保證質(zhì)量，凡使用的槍頭、試管等均經(jīng)0. 5mL/L DEPC水溶液處理3h以上，然后再高壓滅菌，烘干。若為進(jìn)口已處理的無RNase和DNase的槍頭、試管可不必處理直接使用。
（e）各種溶液的配制：凡是水溶性液體均用1mL/L DEPC水配制。
2）樣品制備及其所涉及的試劑包括：
（a）緩沖溶液
1×PBS緩沖溶液：NaCl 8g，Na2HPO4 2.9g，KCl 0.2g，KH2PO4 0.2g，溶入1000mL超純水；
3×PBS緩沖溶液：NaCl 24g，Na2HPO4 8.7g，KCl 0.6g，KH2PO4 0.6g，溶入1000mL超純水；
通常配制成10×PBS的儲備液，3×PBS和1×PBS可用DEPC水稀釋獲得。
（b）4%多聚甲醛（Paraformaldehyde, PFA）
稱取2gPFA加入30ml約60℃的熱水，滴幾滴20%NaOH放在磁力攪拌器攪拌至完全溶解。然后向其中加入16.5ml 3×PBS緩沖液，在冰浴中充分混勻冷卻，冷卻后，用HCl調(diào)整至中性（7.2左右），拿出攪拌子。向PFA溶液中加入超純水，定容在50ml。用 0.45微米的膜過濾后使用。（室溫或4℃保存?zhèn)溆茫?br />
注意：
1、配制時(shí)應(yīng)在通風(fēng)條件下操作，并避免接觸皮膚和吸入（戴手套及口罩），因PFA有較強(qiáng)的固定作用及毒性，對粘膜及皮膚有固定及毒性，刺激作用；
2、加熱時(shí)，溫度不宜過高，常為60~65℃，否則，PFA降解失效；
3、配制好的PFA雖可存放一定時(shí)間，但過久的液體，固定效果下降，應(yīng)盡早使用。
4% PFA是目前原位雜交組織化學(xué)技術(shù)中最常用的固定液，它能較好地保持組織及細(xì)胞內(nèi)的RNA，同時(shí)對形態(tài)保持也較好。樣品固定時(shí)間在2～3小時(shí)，RNA含量較為恒定。過度延長固定時(shí)間會引起細(xì)胞內(nèi)生物大分子的過度交聯(lián)，影響探針的穿透力，降低雜交效率。
（c）配制50%，80%，98%無水乙醇溶液，每個(gè)總量20mL。
（d）DAPI溶液
用1mlddH2O將DAPI溶解，制得2.9 mM的DAPI溶液（1mg DAPI/1mL H2O）。（DAPI不能直接用PBS等緩沖液溶解，需要先用水將其溶解）。取適量DAPI水溶液加到PBS中，制備成10～50 µM的DAPI溶液。
3）取樣及保存方法
（a）反應(yīng)器沉淀前取樣2～5mL至離心管。
（b）離心（2000r/min）5min，去上清液（加蒸餾水重復(fù)兩次）。
（c）樣品加入1mL多聚甲醛，搖勻，4℃下放置3h。
（d）樣品離心(12000r/min)5min，去上清夜。
（e）加入1×PBS，搖勻，離心(10000r/min)5min，去上清夜（重復(fù)3次）。
（f）加0.5mL 1×PBS，0.5mL無水乙醇，搖勻，-20℃保存（可保存6個(gè)月）。
4）樣品固定：
稀釋樣品3～5倍，對樣品進(jìn)行超聲處理（3W超聲2～3min，沉降1min，去沉淀物，5W超聲5min），將活性污泥絮體打散成單個(gè)細(xì)胞以便于顯微鏡 計(jì)數(shù)。然后取3μL樣品涂于包埋明膠的玻片上（檢查樣片本底），37℃的熱烘箱固定2h（或者在空氣中干燥2h或者過夜）。依次用50%、80%、98% （質(zhì)量比）乙醇浸漬3min，對細(xì)胞進(jìn)行脫水后，立放，并進(jìn)行干燥。
5）樣品雜交
試驗(yàn)所涉及的緩沖液包括雜交緩沖液（Hybridization Buffer, HB）和淋洗緩沖液（Washing Buffer, WB），其組分如表1-1和表1-2。
表1-1 雜交緩沖液（Hybridization Buffer）
5% 10% 20% 30% 35% 40%
0.05%SDS（μL） 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2
50mMTri-HCl（μL） 24 24 24 24 24 24
5mol NaCl（mL） 4.32 4.32 4.32 4.32 4.32 4.32
甲酰胺（mL） 1.2 2.4 4.8 7.2 8.4 9.6
蒸餾水（mL） 18.4548 17.2548 14.8548 12.4548 11.2548 10.0548
探針 Nsm156 Ntcoc206 Ntspn693 Nsv443 Ntspa662 NSO1225 Nmv NIT3
表1-2 淋洗緩沖液（Washing Buffer）
組分 體積
0.05%SDS 0.6μL
50m MTri-HCl 12μL
5mol NaCl 2.16mL
蒸餾水 42.8274mL
（a）吸取2mL雜交緩沖液遍布在雜交盒內(nèi)折好的吸水紙上，將已固定好樣品的載玻片放入雜交管中，然后在46℃雜交爐中放置數(shù)分鐘。
（b）吸取10μL探針貯存液和80μL雜交緩沖液混合后，用箔紙包好放入46℃雜交爐中預(yù)熱數(shù)分鐘；探針貯存液濃度為25ng/μL，用無菌水稀釋購買的探針，實(shí)驗(yàn)用的探針序列及雜交條件見表1-3所示。
表1-3用于檢測樣品中AOX、NOX的寡核苷酸探針及雜交條件
探針 探針序列(5’～3’) 標(biāo)記細(xì)菌種屬1 濃度a
NSO1225 CGCCATTGTATTACGTGTGA Ammonia oxidizing beta-proteobacteria 35
Nsv443 CCGTGACCGTTTCGTTCCG Nitroso-spira, -lobus, -vibrio 30
Nmv TCCTCAGAGACTACGCGG Nitroso-coccus 35
Ntspa662 GGAATTCCGCGCTCCTCT Nitrospira 35
NIT3 CCTGGCTCCATGCTCCG Nitrobacter 40
Ntcoc206 CGGTGCGAGCTTGCAAGC Nitrococcus mobilis 10
Ntspn693 TTCCCAATATCAACGCATT Nitrospina gracilis 20
注：
（a） 表示雜交緩沖液中去離子甲酰胺濃度（%）
（c）吸取9μL預(yù)熱后的探針稀釋液涂于載玻片待測樣品上，然后將載玻片迅速地移回雜交管中于46℃下進(jìn)行雜交（黑暗中進(jìn)行），雜交時(shí)間為2～3h；
（d）雜交后的洗脫：打開恒溫水浴槽，加熱到48℃，對雜交緩沖液、淋洗緩沖液進(jìn)行預(yù)熱。雜交盒中取出載玻片用雜交緩沖液沖洗樣品后，快速放入淋洗緩沖液，48℃水浴20min后用4℃冰水，沖洗樣品，樣品潔凈臺中揮干。
DAPI染色
每孔滴9uLDAPI，4℃暗處5min，4℃冰水（BPS緩沖溶液）沖洗，揮干。用帶有360 nm激發(fā)波長，460nm發(fā)射波長的濾光片的熒光顯微鏡觀察細(xì)胞。DAPI（4，6-diamido-2-phenylindole）染色用于全細(xì)胞計(jì)數(shù)。
封片
涂封片劑，蓋蓋玻片，無氣泡后指甲油封裝。
熒光顯微鏡進(jìn)行檢測
每個(gè)樣品及每個(gè)探針都采集20個(gè)不同區(qū)域。每個(gè)區(qū)域中的細(xì)胞個(gè)數(shù)要超過1000個(gè)，然后進(jìn)行平均以獲得每個(gè)探針對于每個(gè)樣品的雜交結(jié)果。細(xì)菌豐度或細(xì)菌數(shù) 目（cells/g或cells/L）為AS1/(S2V)，其中A為視野中細(xì)菌平均數(shù)；S1為樣品涂抹面積；S2為視野涂抹面積；V為樣品體積。 |
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