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[求助]
SDS高鹽法提取土壤微生物——求教各位批評指正
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備注： 該方法是參照一個河南師范大學的碩士論文進行的 疑問： 實驗進行至步驟 ④后，離心完了，上層出現(xiàn)一層白色的藥片狀層面 實驗進行至步驟 ⑤后，上層為氯仿，下層為牛奶狀的乳狀溶液，并沒有得到上清 這是什么原因呢，苦苦跪求，謝謝！ 具體方法為——參照周集中的SDS裂解法[179]，并作改良。具體如下： ① 取適量活性污泥樣品于1.5 ml滅菌離心管中，12000 rpm離心10 min，棄上清， 得樣品濕重50~100 mg； ② 用1.5 ml磷酸緩沖液（0.1M，pH 8.0）洗滌樣品2~3次； ③ 棄上清，加入約800μl DNA提取液重懸，并加入約90μl 20%SDS水溶液，混 勻，65℃水浴2 h，每隔15~20 min上下顛倒幾次； ④ 室溫6000 rpm離心10 min，棄上清（應該是取上清吧）； ⑤ 加入等體積PCI溶液（酚：氯仿：異戊醇＝25:24:1），混勻，靜置3~5min，于 室溫6000 rpm離心10 min，棄上清（也應該是取上清吧），重復2~3次直到蛋白質層消失為止； ⑥ 加入0.6倍體積的異丙醇，混勻，4℃過夜（3個小時以上也可以）； ⑦ 在4℃條件下，12000 rpm離心15~30 min，回收DNA； ⑧ 棄上清，加入70%乙醇洗滌，4℃、12000 rpm離心3~5 min，棄上清，風干DNA， 無酒精味為止； ⑨ 用TE緩沖液約50μl溶解DNA，-20℃保存； ⑩ 用1％瓊脂糖凝膠電泳檢查DNA片段。 左側為步驟 ⑤后情況，右側為左側去上層，加苯酚離心后狀況，下層變澄清～～～ [ Last edited by lilylove170 on 2012-6-11 at 17:32 ] |
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