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1289622

木蟲 (正式寫手)

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專業(yè): 藥物設(shè)計(jì)與藥物信息

[求助] 【求助】SRB法細(xì)胞檢測(cè)操作步驟的一些問題

SRB檢測(cè)的操作步驟：　
　1)細(xì)胞固定：藥物作用時(shí)間終點(diǎn)時(shí)，每孔加入50μL4℃預(yù)冷的TCA溶液(30%，w/v)固定細(xì)胞，TCA溶液的終濃度為10%。靜置5 min移入4℃冰箱中固定1 h，取出用去離子水沖洗5遍，室溫晾干。
問題：
加TCA時(shí)為什么要逐滴加入，直接加入不行嗎？
TCA固定細(xì)胞的原理是什么？
為什么要先在室溫下 5min，然后再4攝氏度放置1小時(shí)？
有的說是晾干，有的說可以烘干，都可行嗎？
為什么必須干燥，把水甩干凈后直接進(jìn)入染色步驟不行嗎？室溫晾干后可以長(zhǎng)時(shí)間放置嗎（比如過夜）？
4攝氏度放置1小時(shí)是什么作用？放半個(gè)小時(shí)會(huì)影響固定和測(cè)量結(jié)果嗎？
為什么要先固定細(xì)胞在染色，直接染色不行嗎（因?yàn)榧?xì)胞是貼壁的，不固定也是長(zhǎng)在底部的）？

　　2)染色：待96孔板室溫下晾干后，每孔加入0.4%(w/v)的SRB染液(1%的乙酸配制)70μL，染色30 min后倒掉染液，用1%(v/v)乙酸沖洗4次，去除未結(jié)合的染料，室溫晾干。

問題：
SRB對(duì)細(xì)胞染色的原理是什么？
染色是化學(xué)結(jié)合還是物理結(jié)合？
為什么不對(duì)死細(xì)胞染色？
室溫晾干后能放多久（可以過夜放置嗎）？
為什么必須干燥，把酸甩干凈后直接加入tris堿不行嗎？
這步的干燥也可以用烘箱烘干嗎？

　　3)檢測(cè)：用100μL非緩沖Tris-base堿液(10mM，pH=10.5)溶解與細(xì)胞蛋白結(jié)合的染料，水平搖床上振蕩20min，采用酶標(biāo)儀540nm處測(cè)定光吸收值。操作中，應(yīng)注意洗除染料時(shí)操作需迅速，避免用移液器吸取液體，防止動(dòng)作過慢造成與細(xì)胞蛋白結(jié)合的染料解吸附。

細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)：
四個(gè)象限，每個(gè)象限16格（4×4），請(qǐng)問每個(gè)象限多少個(gè)細(xì)胞數(shù)范圍計(jì)數(shù)準(zhǔn)確？

因?yàn)橹八氵^，細(xì)胞濃度稀釋4倍后得到的濃度（22萬個(gè)/ml）與不稀釋得到的濃度（113萬個(gè)/ml)兩者不是成四倍的關(guān)系，并且22×4與113差異比較大

操作步驟中的SRB有鈉鹽形式的也有酸式的，應(yīng)該用那種？?jī)烧叨家粯樱?br />

此方法檢測(cè)到的OD值達(dá)不到1.5-2.0的范圍，大部分是在0.2-1.0這個(gè)范圍，請(qǐng)問這個(gè)范圍內(nèi)測(cè)得的結(jié)果準(zhǔn)確嗎？（515nm檢測(cè)波長(zhǎng)）

[ Last edited by 1289622 on 2012-6-21 at 06:51 ]

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