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zhang8826857鐵桿木蟲 (著名寫手)
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大家做RT-qPCR設(shè)計(jì)引物用的什么軟件呀？
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大家做RT-qPCR設(shè)計(jì)引物用的什么軟件呀？熒光定量PCR的引物應(yīng)該和常規(guī)的PCR引物不一樣吧，應(yīng)該對引物要求更高吧。 還有個(gè)問題，primer5就是primer premier5嗎？都是MIT開發(fā)的嗎？ |
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西瓜
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【答案】應(yīng)助回帖
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zhang8826857: 金幣+10, ★★★很有幫助, 西瓜哥就是給力�。。�！ 2012-06-20 16:58:55
小丹木木: 金幣+3, MolEPI+1, 西瓜斑斑實(shí)在是太給力了 2012-06-20 17:22:16
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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小丹木木: 金幣+3, MolEPI+1, 西瓜斑斑實(shí)在是太給力了 2012-06-20 17:22:16
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我是只用Primer Premier 5（Primer 5）來設(shè)計(jì)，主要參考了Takara的試劑盒說明書上對于引物設(shè)計(jì)的要求（如圖）。 其他就是普通PCR引物的要求了，而這些只要看引物設(shè)計(jì)軟件的評分就可以了，評分越高越好。我自己用Primer Premier 5設(shè)計(jì)，大部分都是95分以上的才用。 如果是用Sybr Green，由于雙鏈DNA都會引起熒光信號，所以盡量不要有錯(cuò)配、二聚體、發(fā)夾結(jié)構(gòu)這些東西，在這里，這些比Tm值、GC含量還要重要些。實(shí)在免不了，那么其結(jié)合強(qiáng)度也不能高�？梢钥丛u分里面的AG值（如圖），絕對值越大，結(jié)合強(qiáng)度越大。具體的我不是很清楚，只記得以前生物信息學(xué)上老師說過不能大于10。我自己有好幾對引物的二聚體AG值在-6左右，用著倒是很正常。 另外，熒光定量PCR常用cDNA為模板來檢測表達(dá)量，這種時(shí)候就需要避免基因組DNA的干擾。在引物設(shè)計(jì)上，有一些技巧可以避免基因組DNA得到擴(kuò)增：1.讓上下游引物中間隔著一個(gè)大的內(nèi)含子，這樣基因組DNA的產(chǎn)物由于太大，擴(kuò)增效率很低。 2.讓引物的5'端和3'在不同的外顯子上，這樣引物就不能結(jié)合到基因組DNA上啦。 以上就是本人在設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物上的一些經(jīng)驗(yàn)。引物到底好不好，最好還是要看熒光定量PCR的結(jié)果，看熔解曲線，如果只有單一的峰，說明產(chǎn)物很特異，引物可以用。 |
2樓2012-06-20 16:28:28
zhang8826857
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5樓2012-07-01 13:13:01
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6樓2012-07-01 15:34:12
zhang8826857
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7樓2012-07-01 18:21:32
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10樓2012-12-11 23:43:04
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