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高速離心機(jī)的離心分離方法和特點(diǎn)簡(jiǎn)析
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制備型超高速離心機(jī)的幾種分離方法： A.差速離心：逐次增加離心力，每次可沉降樣品溶液中的一些組份。 差速離心是一種最常用的方法。在這種方法中，離心管在開(kāi)始時(shí)裝滿(mǎn)了均一的樣品溶液。通過(guò)在一定速度下一定時(shí)間的離心后，就可得到兩個(gè)部份：沉淀和上清液。 通常在第一次離心時(shí)把大部分不需要的大粒子沉降去掉。這時(shí)所需的組份大部分仍留在上清液中。然后將收集到的上清液以更高速度離心，把所需的粒子沉積下來(lái)。離心的時(shí)間要選擇得當(dāng)，使大部份不需要的更小的粒子仍留在上清液中。對(duì)于得到的沉淀和上清液可以進(jìn)行進(jìn)一步的離心，直到達(dá)到所需要的分離純度為止。 差速離心的特點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單，但分離純度不高。 B.密度梯度離心法：可以同時(shí)使樣品中幾個(gè)或全部組份分離，具有很好的分辨率。 (1)速率區(qū)帶法(ratezonal)： 根據(jù)樣品中不同粒子所具有的不同的尺寸大小及沉降速度(S)。大致步驟如下： 在離心管中裝入密度梯度溶液，溶液的密度從離心管頂部至底部逐漸增加(正梯度)。 將所需分離的樣品小心地加至密度梯度溶液的頂部。樣品在梯度溶液表面形成一負(fù)梯度。 由于不同大小的粒子在離心力作用下，在梯度中移動(dòng)的速度不一樣，所以經(jīng)過(guò)離心后會(huì)形成幾條分開(kāi)的樣品區(qū)帶。 注意：樣品粒子的密度必須大于梯度液注中任一點(diǎn)的密度。離心過(guò)程必須在區(qū)帶到達(dá)管子底部前停止。 (2)等密度離心法(isopycnic)： 根據(jù)粒子的不同密度來(lái)分離。離心過(guò)程中，粒子會(huì)移至與它本身密度相同的地方形成區(qū)帶。 密度樣度的選擇要使梯度的范圍包括所有待分離粒子的密度。樣品可以在密度梯度液粒上面或均勻分布在密度梯度中。經(jīng)離心后，樣品粒子達(dá)到它們的平衡點(diǎn)。 注意：平衡后粒子的分離完全由其密度決定，與時(shí)間無(wú)關(guān)，此時(shí)再改變離心轉(zhuǎn)速，只能改變區(qū)帶的相對(duì)位置。 密度梯度分析法 (1)梯度介質(zhì)性質(zhì)與選擇： A、應(yīng)具備的性質(zhì)： 梯度物質(zhì)的選擇原則是滿(mǎn)足分離方法的基本要求，一個(gè)理想的密度材料標(biāo)準(zhǔn)它應(yīng)是： 所形成的溶液密度應(yīng)包括所需要的密度范圍。 具有某些性質(zhì)，如折射率，據(jù)此可測(cè)定它的濃度。 所形成的溶液粘度低。 不損傷所分離的樣品。 離心分離后容易除去。 不妨礙分離積分的分析。 B、常用介質(zhì)種類(lèi)： 表一、常用梯度材料在20℃密度 B.梯度介質(zhì)應(yīng)用范圍： 表二、等密度梯度介質(zhì)的應(yīng)用 表三、各種大分子在蔗糖梯度液中的大約密度 (2)、梯度溶液的準(zhǔn)備： 計(jì)算,稀釋 (3)梯度形狀 梯度形狀分：線型、等速型、階梯型、平坦型、陡峭型指數(shù)梯度。 梯度形狀對(duì)于分離是否成功非常重要： 最常用的是線型梯度，適用于分離蛋白質(zhì)、酶、激素、核糖體亞基和一些植物病毒;等速型適用于分離脂蛋白和一些需上浮分離樣品;不連續(xù)或階梯型梯度最適用于分離整細(xì)胞、亞細(xì)胞組分以及純化一些哺乳類(lèi)動(dòng)物病毒或昆蟲(chóng)病毒。等速梯度以及長(zhǎng)液柱可增進(jìn)分離能力，適用于分離核糖體亞基、多核糖體及植物病毒。 B.梯度柱制備： 梯度液柱可以用手工或梯度儀制備 半注法： 為縮減離心時(shí)間，或分離樣品較少可用半注法：下半管鋪置梯度介質(zhì)，中間加樣品，上面鋪Buffer或液體石臘油。 (4)加樣方法與加樣量： 將樣品加到梯度液柱上，針尖和離心管成45-60°角度，慢慢地將樣品沿管壁流到液面上去，對(duì)于DNA一類(lèi)易斷的脆弱樣品，應(yīng)該用孔徑較大的移液管代替針頭，以避免剪切力對(duì)樣品的切割作用。樣品濃度是梯度柱最小密度的1/10(W/W)。 (5)轉(zhuǎn)子的選擇與效應(yīng)： (6)分離區(qū)帶的回收及檢測(cè) 離心后所形成的區(qū)帶樣品的回收方法基本有四種： a.穿刺法 穿刺離心管底部，使梯度溶液滴出，將一具有合適閥門(mén)的蓋帽放在離心管頂，可控制滴出速度。 b.虹吸法： 將一毛細(xì)管輕輕插入管底，盡量防止梯度抖動(dòng)，用微量泵逐漸滴取，以一定量滴數(shù)或體積部分收取。 c.加壓法： 通過(guò)一針管將高密度的液體泵入到梯度離心管的底部，部分收集換出的溶液。 d.切割法： 采用專(zhuān)用的切割刀切割所需區(qū)帶。 區(qū)帶檢測(cè)： 所謂區(qū)帶檢測(cè)，實(shí)際上是對(duì)水平轉(zhuǎn)子或角轉(zhuǎn)子和垂直轉(zhuǎn)子離心管中的分離物質(zhì)所做的監(jiān)測(cè)，通常只是測(cè)量在260或280mm時(shí)長(zhǎng)的吸收值，以決定梯度中的核酸或蛋白的整個(gè)分布，這個(gè)操作通常稱(chēng)之為在線(online)監(jiān)測(cè)。 |
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