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煙草或胡蘿卜的懸浮培養(yǎng)方法 （來自云端實驗室）
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實驗概要 把煙草或胡蘿卜愈傷馴化成懸浮細胞。 主要試劑 1. 附加2%蔗糖，1%甘露醇，500mg/L水解乳蛋白，1.5ml/L 2，4-D的MS培養(yǎng)基，PH調到5.6~6.2。 2. 8%三氧化鉻（CrO3）。 實驗材料 松軟的煙草或胡蘿卜愈傷組織。 實驗步驟 1. 用鑷子夾取出生長旺盛的松軟愈傷組織，放入三角瓶中并輕輕夾碎。每100ml三角瓶含滅過菌MS培養(yǎng)基10~15ml，每瓶接種1~1.5g愈傷組織，以保證最初培養(yǎng)物中有足夠量的細胞。 2. 將已接種的三角置于旋轉式搖床上。在100r/min，25~28℃條件下，進行振蕩培養(yǎng)。 3. 經6~10天培養(yǎng)后，若細胞明顯增殖，可向培養(yǎng)瓶中加新鮮培養(yǎng)基10ml，必要時，可用大口移液管將培養(yǎng)物分裝成兩瓶，繼續(xù)培養(yǎng)。（若細胞無明顯增殖，可能是起始材料不適當，應考慮用旺盛增殖期的愈傷組織重新接種）�？蛇M行第一次繼代培養(yǎng)。 4. 縣浮培養(yǎng)物的過濾：按“3”法繼代培養(yǎng)幾代后，培養(yǎng)液中應主要由單細胞和小細胞團（不多于20個細胞）組成。若仍含有效大的細胞團，可用適當孔徑的金屬網篩過濾，再將過濾后的縣浮細胞繼續(xù)培養(yǎng)。 5. 細胞計算。取一定體積的細胞縣液，加入2倍體積的8%的三氧化鉻（CrO3），置700℃水浴處理15min。冷卻后，用移液管重復吹打細胞懸液，以使細胞充分分散，混勻后，取一滴縣液置入血細胞計數板上計數。 6. 制作細胞生長曲線：為了解縣浮培養(yǎng)細胞的生長動態(tài)，可用以下方法繪制生長曲線圖： （1）鮮重法（fresh weigh method） 在轉代培養(yǎng)的不同時間，取一定體積的懸浮細胞培養(yǎng)物，離心收集后，稱量細胞的鮮重，以鮮重為縱座標，培養(yǎng)時間為橫座標，繪制鮮重增長曲線。 （2）干重法（dry weigh method ） 可在稱量鮮重之后，將細胞進行曲烘干，再稱量干重。以干重為縱坐標，培養(yǎng)時間為橫坐標，繪制細胞干重生長曲線。 上述兩種方法均需每隔2天取樣一次，共取7次，每個樣品重復三次，整個實驗進行期間不再往培養(yǎng)瓶中換入新鮮培養(yǎng)液。 7. 細胞活力的檢查。對于初學者，往往需要檢測活細胞的比率。可在培養(yǎng)的不同階段，吸取一滴細胞縣液，放在載玻片上，滴一滴0.1%的酚藏花紅溶液（用培養(yǎng)基配制）染色，在顯微鏡下觀察。幾活細胞均不著色，而死細胞則很快被染成紅色。也可用0.1%熒光雙醋酸酯溶液染色，凡活細胞將在紫外光誘發(fā)下顯示藍絕色熒光，有經驗的操作者，則可根據細胞形態(tài)，胞質環(huán)流判別細胞的死活。 8. 細胞再生能力的鑒定：為了解懸浮培養(yǎng)細胞是否仍具有再生能力，可將培養(yǎng)細胞轉移到瓊脂固化的培養(yǎng)基上，使基再形成愈傷組織，進而在分化培養(yǎng)基上，誘導植株的分化。 注意事項 1. 上述步驟均滅菌操作，培養(yǎng)基、用具、器皿等要高壓滅菌后方可使用。 2. 如培養(yǎng)液混濁或呈現乳白色，表明已污染。 3. 每次繼代培養(yǎng)時，應在倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)物中各類細胞及其它殘余物的情況以有意識地留下圓細胞，棄去長細胞。 更多詳細內容見E V E R L A B 云端 實驗室 |
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