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tzaixmc木蟲 (正式寫手)
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[求助]
細菌基因組文庫構建的相關問題
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目前想要用質粒pUCM-T建一個2-6kb的細菌基因組的質粒文庫。實驗室沒人做過，啥也不懂，望高手出來解答一下。謝謝！ 1. 質粒載體酶切后要先切膠回收，再用CIAP處理完后再用切膠回收嗎？ 2. 2-6kb的回收片段和末端磷酸化的載體連接時加入量多少比較合適？有人說按DNA載體和外源片斷以6:1的摩爾比，那要分別加多少夠做一次轉化？ 3. 如果我想建這個庫要8000的克隆，那我如果一次轉化只有500個怎么辦？是多做累積到8000個還是一次多做幾管連接轉化累計到8000個克隆？ 4. 對構建出來的文庫我想用池的方式保存。我想要提取里面的質粒轉化打另外一株菌中做活性檢測，那這個質粒提取我是直接提取一個池的質粒，還是從這個池里接種一點到新的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)起來再做轉化？ 望高手出來解答一下啊，非常感謝！ |
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1.載體質粒你先切膠回收，之后CIAP，最后直接溶液回收就可以了。 2.關于連接體系，一般做10ul吧，黏性末端采用T4連接酶吧，我一般體現(xiàn)為：1ul 10Xbuffer，1ul 酶，0.5-1ul 載體，剩余的全加目的片段補足至10ul。10ul連接體系轉化一管，你的轉化效率有點低，我一般連接一管10ul能長幾千個吧。要是不夠的話，你就多連接幾管，多作幾個轉化。 3.關于池保存，你可以將池洗下來的菌，添加適量培養(yǎng)基搖勻（我一般搖5-8h，轉速高些）后取一些菌提質粒，也可以按你說的，待洗下來菌液的搖勻后，轉接一些從新?lián)u菌提質粒。  |
3樓2012-07-20 11:07:41
jinpeng_6118
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載體和目的片段的濃度沒準確測過，也就簡單跑了下核酸電泳。一般來說，目的片段與載體的摩爾比例在10:1比較合適。你的意思是，目的片段比載體多，連接不完全吧？，假設這樣說，10ng DNA就完全包含你的所有DNA多樣性了，連接時加1000ng DNA，是比載體多了很多，但是你的每個目的多樣性DNA就有100個參與連接，這樣你的覆蓋完整率就很高了。 |
5樓2012-07-20 15:47:03
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