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[求助] 3' RACE疑問

我提取了RNA，用設(shè)計(jì)的兼并引物擴(kuò)出了目的基因的部分序列，然后根據(jù)得到的序列設(shè)計(jì)特異性引物，進(jìn)行3’ RACE，使用的是Takara的3’Full RACE Core Set Ver.2.0試劑盒。我共設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物，分別與試劑盒自帶的Outer primer進(jìn)行Outer PCR時(shí)，擴(kuò)出的條帶如圖1所示。（其中RNA 1 和RNA 2 是我兩次提取的RNA，引物1在擴(kuò)出的部分序列5’端的50bp處，引物2在擴(kuò)出部分序列5’端的143bp處）。
之前用兼并引物擴(kuò)出出部分序列，是用的RNA1 反轉(zhuǎn)錄成的cDNA為模板的。當(dāng)用RNA1進(jìn)行3’RACE時(shí)，引物1條帶很淡，而引物2進(jìn)卻有兩條帶，同樣對(duì)于RNA 2，3’RACE的結(jié)果也不相同。我很疑惑，RACE可以出現(xiàn)兩條帶嗎？如果是因?yàn)橐锾禺愋圆桓叨霈F(xiàn)兩條帶，為什么不同的RNA的結(jié)果又不一樣呢？這是引物的問題，還是提取的RNA質(zhì)量的問題呢？還需要進(jìn)行Inner PCR反應(yīng)嗎？
請(qǐng)各位幫個(gè)忙！不勝感激！��！

圖1 3’ RACE電泳結(jié)果

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有你的目的條帶嗎？有的話，拿去直接測一下就知道了，如果沒有，那就沒用，可能要重新做

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2樓2012-07-20 11:28:56

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2樓: Originally posted by jl860822 at 2012-07-20 11:28:56
有你的目的條帶嗎？有的話，拿去直接測一下就知道了，如果沒有，那就沒用，可能要重新做

因?yàn)槟康男蛄惺俏粗�，不知道其�?zhǔn)確長度，所以，不知道是否是目的條帶……

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3樓2012-07-21 09:18:44

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【答案】應(yīng)助回帖

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3樓: Originally posted by 含羞草liu at 2012-07-21 09:18:44
因?yàn)槟康男蛄惺俏粗�，不知道其�?zhǔn)確長度，所以，不知道是否是目的條帶……...

你可以測一下看看到底是什么序列，你總有個(gè)實(shí)驗(yàn)?zāi)康陌�，不知道目的序列有點(diǎn)不對(duì)吧

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4樓2012-07-21 17:39:43

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4樓: Originally posted by jl860822 at 2012-07-21 17:39:43
你可以測一下看看到底是什么序列，你總有個(gè)實(shí)驗(yàn)?zāi)康陌�，不知道目的序列有點(diǎn)不對(duì)吧...

是這樣的，目的序列是未知的，我是根據(jù)同源種的序列設(shè)計(jì)的兼并引物，擴(kuò)出了一部分序列，再根據(jù)這段序列設(shè)計(jì)特異性引物，進(jìn)行3’RACE，以擴(kuò)出其全長。后面還要再進(jìn)行5’RACE的。因?yàn)槠錅?zhǔn)確的序列未知，所以用引物進(jìn)行RACE擴(kuò)增時(shí)也不知目的條帶的長度……

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5樓2012-07-21 19:48:41

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其實(shí)你的這個(gè)RACE做的已經(jīng)是挺好的了，你所在意的出現(xiàn)兩條帶的情況，應(yīng)該是非特異性帶，跟模板，引物，反應(yīng)條件都有關(guān)系。

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6樓2012-07-21 19:56:28

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6樓: Originally posted by xmchen1015 at 2012-07-21 19:56:28
其實(shí)你的這個(gè)RACE做的已經(jīng)是挺好的了，你所在意的出現(xiàn)兩條帶的情況，應(yīng)該是非特異性帶，跟模板，引物，反應(yīng)條件都有關(guān)系。

我不知道這個(gè)RACE的結(jié)果是否可信，因?yàn)閮纱翁岬腞NA用相同的引物，得出的結(jié)果不一樣，也就是非特異性帶的問題。除模板和引物不同外，RACE Outer PCR的條件是一樣的。我真的很疑惑�，F(xiàn)在已經(jīng)將后面的三條帶的PCR產(chǎn)物送去測序了，在等結(jié)果……

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7樓2012-07-21 20:51:38

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yananhl

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2樓: Originally posted by jl860822 at 2012-07-20 11:28:56
有你的目的條帶嗎？有的話，拿去直接測一下就知道了，如果沒有，那就沒用，可能要重新做

我想問下，我做RACE5‘端，做出來的是單條帶，但不是自己的基因，是引物的問題嗎？我換了兩次引物了，謝謝了！

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8樓2012-07-22 19:37:37

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不要糾結(jié)了，引物1和引物2，中間隔了多大，看看是不是兩條亮帶大小的差值，如果是，證明你RACE中引物1和引物2均成功，趕緊去測序吧。

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9樓2012-07-23 00:15:26

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9樓: Originally posted by nmhsd at 2012-07-23 00:15:26
不要糾結(jié)了，引物1和引物2，中間隔了多大，看看是不是兩條亮帶大小的差值，如果是，證明你RACE中引物1和引物2均成功，趕緊去測序吧。

我已經(jīng)送去測序了，但測序的結(jié)果很不好。我是進(jìn)行雙向測序，5’端使用自己設(shè)計(jì)的引物都能測得序列，3’端使用Outer Primer，測序的結(jié)果均失敗。而且5’端的序列前半部分的圖譜很好，重疊很少，但后半部分重疊很嚴(yán)重。測序公司給我的反饋是，目的序列有較復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，很難測序。要怎樣才能得到較好的RACE結(jié)果呢？我是直接用PCR產(chǎn)物送測的，但如果轉(zhuǎn)化到大腸桿菌里再提取質(zhì)粒，結(jié)果會(huì)好些嗎？

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10樓2012-07-27 16:51:34

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