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含羞草liu新蟲 (小有名氣)
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3' RACE疑問(wèn)
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我提取了RNA，用設(shè)計(jì)的兼并引物擴(kuò)出了目的基因的部分序列，然后根據(jù)得到的序列設(shè)計(jì)特異性引物，進(jìn)行3’ RACE，使用的是Takara的3’Full RACE Core Set Ver.2.0試劑盒。我共設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物，分別與試劑盒自帶的Outer primer進(jìn)行Outer PCR時(shí)，擴(kuò)出的條帶如圖1所示。（其中RNA 1 和RNA 2 是我兩次提取的RNA，引物1在擴(kuò)出的部分序列5’端的50bp處，引物2在擴(kuò)出部分序列5’端的143bp處）。 之前用兼并引物擴(kuò)出出部分序列，是用的RNA1 反轉(zhuǎn)錄成的cDNA為模板的。 當(dāng)用RNA1進(jìn)行3’RACE時(shí)， 引物1條帶很淡，而引物2進(jìn)卻有兩條帶，同樣對(duì)于RNA 2，3’RACE的結(jié)果也不相同。我很疑惑，RACE可以出現(xiàn)兩條帶嗎？如果是因?yàn)橐锾禺愋圆桓叨霈F(xiàn)兩條帶，為什么不同的RNA的結(jié)果又不一樣呢？這是引物的問(wèn)題，還是提取的RNA質(zhì)量的問(wèn)題呢？還需要進(jìn)行Inner PCR反應(yīng)嗎？ 請(qǐng)各位幫個(gè)忙！不勝感激�。。� 圖1 3’ RACE電泳結(jié)果 |
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含羞草liu2樓2012-07-20 11:28:56
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7樓2012-07-21 20:51:38
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9樓2012-07-23 00:15:26
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我已經(jīng)送去測(cè)序了，但測(cè)序的結(jié)果很不好。我是進(jìn)行雙向測(cè)序，5’端使用自己設(shè)計(jì)的引物都能測(cè)得序列，3’端使用Outer Primer，測(cè)序的結(jié)果均失敗。而且5’端的序列前半部分的圖譜很好，重疊很少，但后半部分重疊很嚴(yán)重。測(cè)序公司給我的反饋是，目的序列有較復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，很難測(cè)序。要怎樣才能得到較好的RACE結(jié)果呢？我是直接用PCR產(chǎn)物送測(cè)的，但如果轉(zhuǎn)化到大腸桿菌里再提取質(zhì)粒，結(jié)果會(huì)好些嗎？ |
10樓2012-07-27 16:51:34
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