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chjinzhi銀蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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[求助]
關(guān)于利用融合PCR技術(shù)進(jìn)行點(diǎn)突變的問(wèn)題 已有3人參與
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各位大俠，我現(xiàn)在在做融合PCR以實(shí)現(xiàn)酶切位點(diǎn)的點(diǎn)突變，但我做了將近半年仍做不出結(jié)果，急需要大家的幫助！ 我的擴(kuò)增片段總共1400bp左右，擴(kuò)增片段一個(gè)390bp左右，一個(gè)1100bp左右，兩片段有23bp的重疊。重疊時(shí)總是擴(kuò)增出小片段，不能得到目的片段！重疊時(shí)的溫度我從62度到35度都做了一遍。但都沒(méi)有目的片段。 |
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biology-girl
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2樓2014-07-23 11:49:07
【答案】應(yīng)助回帖
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有可能出問(wèn)題的地方很多，信息不太全只能稍微猜測(cè)一下： 1. 酶。基因片段超過(guò)1kbp的話最好用好一些的酶，普通的taq酶估計(jì)很難做出來(lái) 2. 模板純度。你的兩個(gè)片段重疊時(shí)需要保證片段的純度都比較高，而且片段濃度要一致，不能相差太多。 3. 延伸時(shí)間，可以試著延長(zhǎng)延伸時(shí)間，重疊pcr的閱讀速度比一般pcr要慢些 暫時(shí)想到這么多。 不過(guò)如果你是做點(diǎn)突變的話，應(yīng)該就是要把一個(gè)基因片段中的一個(gè)酶切位點(diǎn)突變吧？如果只是一個(gè)基因片段完全沒(méi)必要做融合pcr，可以直接用普通pcr做點(diǎn)突變. -將你的目的基因連在小體積載體上 -設(shè)計(jì)一對(duì)完全互補(bǔ)的引物覆蓋你要突變，擴(kuò)增整個(gè)載體，當(dāng)然這里需要特殊的聚合酶，可以擴(kuò)增幾kbp的大片段 -酶處理降解模板載體，只留下擴(kuò)增產(chǎn)物，即已點(diǎn)突變的載體 -轉(zhuǎn)染感受態(tài)，涂板，挑菌落，提質(zhì)粒，測(cè)序 實(shí)驗(yàn)方案不超過(guò)兩天，加上測(cè)序最多也就一周。而且不少試劑盒可以做點(diǎn)突變。 |
3樓2014-07-24 03:58:54
ssssllllnnnn 
至尊木蟲(chóng) (知名作家)
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4樓2014-07-24 04:31:14
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