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chjinzhi銀蟲 (正式寫手)
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[求助]
關(guān)于利用融合PCR技術(shù)進行點突變的問題 已有3人參與
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各位大俠，我現(xiàn)在在做融合PCR以實現(xiàn)酶切位點的點突變，但我做了將近半年仍做不出結(jié)果，急需要大家的幫助！ 我的擴增片段總共1400bp左右，擴增片段一個390bp左右，一個1100bp左右，兩片段有23bp的重疊。重疊時總是擴增出小片段，不能得到目的片段！重疊時的溫度我從62度到35度都做了一遍。但都沒有目的片段。 |
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biology-girl
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2樓2014-07-23 11:49:07
【答案】應助回帖
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有可能出問題的地方很多，信息不太全只能稍微猜測一下： 1. 酶�；蚱纬^1kbp的話最好用好一些的酶，普通的taq酶估計很難做出來 2. 模板純度。你的兩個片段重疊時需要保證片段的純度都比較高，而且片段濃度要一致，不能相差太多。 3. 延伸時間，可以試著延長延伸時間，重疊pcr的閱讀速度比一般pcr要慢些 暫時想到這么多。 不過如果你是做點突變的話，應該就是要把一個基因片段中的一個酶切位點突變吧？如果只是一個基因片段完全沒必要做融合pcr，可以直接用普通pcr做點突變. -將你的目的基因連在小體積載體上 -設計一對完全互補的引物覆蓋你要突變，擴增整個載體，當然這里需要特殊的聚合酶，可以擴增幾kbp的大片段 -酶處理降解模板載體，只留下擴增產(chǎn)物，即已點突變的載體 -轉(zhuǎn)染感受態(tài)，涂板，挑菌落，提質(zhì)粒，測序 實驗方案不超過兩天，加上測序最多也就一周。而且不少試劑盒可以做點突變。 |
3樓2014-07-24 03:58:54
ssssllllnnnn 
至尊木蟲 (知名作家)
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4樓2014-07-24 04:31:14
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