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平端 影響連接嗎
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| 本人原核表達載體構(gòu)建總是連接不上，會不會是因為酶切位點EcoR V的斷口是平末端？？？ |
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scutphoenix
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2樓2012-07-25 15:08:47
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5樓2012-07-25 18:20:32
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+2, 鼓勵應(yīng)助 2012-07-26 15:21:17
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一般來說，克隆不成功的原因是載體或外援片段處理不好。常見的情況有兩種： 1. 質(zhì)粒DNA的質(zhì)量不好，導(dǎo)致載體處理不完全（大量的單切或未酶切載體），連接時出現(xiàn)大量的載體自連，形成大量的背景克隆 2.外源基因片段酶切不好，導(dǎo)致外源基因片段無法連入載體。常見的錯誤是總擔(dān)心PCR片段不夠，酶切時PCR產(chǎn)物用量太多。事實上，一般由于PCR產(chǎn)物分子量小，完全酶切PCR產(chǎn)物需要的酶量將切同樣量的載體DNA所需的酶量多得多。一般來說，PCR產(chǎn)物酶切時，用300--500ng的DNA就足夠用了。 關(guān)于雙酶切設(shè)計的問題，可以利用一個在線的雙酶切軟件double digestion disigner ，我以前在小木蟲推薦過，當(dāng)時免費，現(xiàn)在可能收費了，但仍然可以申請免費使用。 利用該軟件進行酶量的精確計算，不用擔(dān)心酶量是否足夠的問題。 |
6樓2012-07-25 20:54:46
7樓2012-07-25 21:46:26
scutphoenix
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8樓2012-07-26 22:11:16
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9樓2012-08-27 08:53:26
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