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yqs129219新蟲 (小有名氣)
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[求助]
pcr擴增無目的條帶啊，
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小弟在做cdna的擴增，做同源序列的克隆，引物是根據(jù)抗病基因保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計的。目的片段500bp，引物是上海生工合成的， 引物為：F：GGI GGI WSI GGI AAR ACI AC R：CAA CGC TAG TGG CAA TCC 單子上F引物和R引物的Tm值分別是56.77和57.3。所用的是pcr mix，，反應(yīng)體系（ mix 12.5ul F引物0.5ul（10uM） R引物0.5ul（10uM） 反轉(zhuǎn)錄得到CDNA稀釋5倍后取2Ul ddh2o補足25ul），反應(yīng)程序：94°3min 94° 30s 退火溫度 72°1min 72°10Min ,31個循環(huán)，退火溫度48 50 52 53 54 55 56 57 58 60 62 64 這么多溫度都試過就是擴增不出來，但是做內(nèi)參就能擴增出來，求高手指點啊。是不是引物的問題，引物有一管剛開始寄過來粉末狀的時候打開過，后來才用DEPC水溶解的，不知道有沒有影響。溶解引物的時候劇烈漩渦有沒有影響呢。求高手賜教， |
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yqs129219
新蟲 (小有名氣)
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2樓2012-08-08 22:02:34
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