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[求助]
硫酸銨沉淀的一些問(wèn)題，求高手幫忙看一下！
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最近在做一種真菌胞外酶的分離，不知道蛋白的具體的性質(zhì)，文獻(xiàn)報(bào)道的種類也比較多。不過(guò)大部分都采用硫酸銨沉淀后，再過(guò)柱子。 我選擇加入固體硫酸銨（考慮到發(fā)酵液大量，加入液體體積太大了），發(fā)酵液離心去沉淀，濾紙抽濾3次，加入EDTA（終濃度為1mM），發(fā)酵液的蛋白含量在10ug/ml左右，做80%的硫酸銨沉淀，全程操作在冰水上進(jìn)行。 在《蛋白技術(shù)手冊(cè)》中，提及加入硫酸銨的時(shí)間再10-20min之內(nèi)，但是又強(qiáng)調(diào)必須等硫酸銨晶體溶解完之后加。我640ml的發(fā)酵液，盡量保證溶解之后再加，總共用了四個(gè)小時(shí)才加完。 之前的預(yù)實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)格保證硫酸銨溶解完之后加，總共用了四天時(shí)間（每天加10個(gè)多小時(shí)）。 兩次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相差不大，復(fù)性之后都損失了將近95%的蛋白，比酶活也下降非常多。在加入硫酸銨的過(guò)程中，花費(fèi)四小時(shí)的實(shí)驗(yàn)，出現(xiàn)了大量的白色泡沫（蛋白變性的結(jié)果），花費(fèi)四天的實(shí)驗(yàn)中泡沫則要少一些。兩次實(shí)驗(yàn)中，收集沉淀，混溶然后離心，有一半都是不溶固體（在加入硫酸銨后，有大量的絮狀沉淀出現(xiàn)，應(yīng)該是這些物質(zhì)）。 有這樣幾個(gè)問(wèn)題 1：不知道硫酸銨的加入時(shí)間以及加入速度，到底是怎么樣的？有過(guò)相關(guān)經(jīng)驗(yàn)的同學(xué)能不能給個(gè)參考~~~（這實(shí)驗(yàn)一直失敗，關(guān)于這個(gè)問(wèn)題各種凌亂...） 2：硫酸銨沉淀這種方法對(duì)于蛋白濃度要求最好是1mg/ml，但是我發(fā)酵液蛋白濃度本來(lái)就極低，原來(lái)就想通過(guò)硫酸銨沉淀得到濃縮液的，實(shí)驗(yàn)失敗是不是與我濃度低有關(guān)？ PS：也想過(guò)其它的方法，譬如聚乙二醇吸水（我將近1L的發(fā)酵液，所用的量實(shí)在太大了...），超濾沒(méi)有相關(guān)設(shè)備，原核表達(dá)的話，估計(jì)又要做個(gè)半年一年的了。實(shí)驗(yàn)卡這里超過(guò)兩個(gè)月了，各種糾結(jié)啊~~ [ Last edited by cc1000ml on 2012-8-10 at 11:42 ] |
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 【分子生物】EPI帖 | 蛋白表達(dá)純化鑒定精華 |
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dshlove
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+3, MolEPI+1, 鼓勵(lì)積極應(yīng)助，解答問(wèn)題 2012-08-10 14:31:38
cc1000ml: 金幣+5, ★有幫助, 感謝回帖~~ 2012-08-10 15:42:06
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+3, MolEPI+1, 鼓勵(lì)積極應(yīng)助，解答問(wèn)題 2012-08-10 14:31:38
cc1000ml: 金幣+5, ★有幫助, 感謝回帖~~ 2012-08-10 15:42:06
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我覺(jué)得你的操作太費(fèi)時(shí)間了。 其實(shí)，640ml的體積對(duì)生產(chǎn)來(lái)說(shuō)已經(jīng)很小了，所以，我的建議是先將硫酸銨配置成飽和溶液，然后算好要加的體積量，用蠕動(dòng)泵滴加。同時(shí)用小轉(zhuǎn)子攪拌，速度要慢。這樣就能得到比較均一的乳狀懸濁液。不會(huì)出現(xiàn)你說(shuō)的絮狀沉淀還有泡沫了，再離心取沉淀。再做下一步處理。 固體硫酸銨加入到發(fā)酵液你還要不斷攪拌，會(huì)產(chǎn)生很多泡沫，蛋白變性就無(wú)法避免了，而且，固體會(huì)導(dǎo)致局部濃度過(guò)高，形成絮狀沉淀。配置飽和溶液就能解決了。 |
2樓2012-08-10 14:16:18
mitocam
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11樓2012-08-11 15:52:43
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幾點(diǎn)疑問(wèn) 1：如果按照640ml的發(fā)酵液，到80%濃度，需要硫酸銨飽和溶液將近500ml，體積幾乎是翻倍了。如果加入500ml飽和溶液，那么滴加速度該如何控制呢？（如果加入固體會(huì)有明顯晶體可以看得到，可以作為一個(gè)快慢標(biāo)準(zhǔn).） 2：再者是一個(gè)過(guò)程總共需要多少時(shí)間的問(wèn)題，因?yàn)槟莻�(gè)手冊(cè)中明確說(shuō)明要在10-30min內(nèi)加完，所以我個(gè)人覺(jué)得加硫酸銨的時(shí)間應(yīng)該是一個(gè)比較重要的因素.不知道您是怎樣看這個(gè)問(wèn)題的。 3：關(guān)于絮狀沉淀和泡沫的問(wèn)題。 我在加入過(guò)程中也是使用磁力攪拌機(jī)，，氣泡之所以很多而且聚集的原因主要是蛋白變性，使溶液粘度增加，攪拌產(chǎn)生的氣泡難以破碎。氣泡應(yīng)該是蛋白變性的一個(gè)表現(xiàn)。 絮狀沉淀是在加完硫酸銨之后，靜止一小時(shí)后可以看得到的，在剛加完的時(shí)候也是一種比較均一的懸濁液。 十分感謝您的回復(fù)~~~ |
3樓2012-08-10 15:40:28
dshlove
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【答案】應(yīng)助回帖
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針對(duì)你的問(wèn)題，我就自己知道的回答下： 1：滴加的速度基本就是一秒一到兩滴的速度，當(dāng)然你可以按照蛋白的要求，在某一規(guī)定時(shí)間內(nèi)全部加進(jìn)去。 2：其實(shí)手冊(cè)說(shuō)明只是一個(gè)大概的，一般蛋白55%情況下就能沉淀差不多了，85%能獲得最大量，所以你要結(jié)合你的蛋白，在不產(chǎn)生局部沉淀情況下盡量快。但是，我覺(jué)得加的時(shí)間不是一個(gè)特別重要的因素，我覺(jué)得濃度才是比較重要的，畢竟沉淀過(guò)程其實(shí)也是一個(gè)去雜和富集的過(guò)程。 3：產(chǎn)生氣泡，說(shuō)明你攪拌得太劇烈了。攪拌必須是有規(guī)則和溫和的。粘度增加可能不是蛋白的原因，也有可能是核酸太多了。氣泡有時(shí)候可以在樣品里補(bǔ)點(diǎn)NaCl，可以消泡的。 加完硫酸銨之后為什么要靜置��？可以用轉(zhuǎn)子低轉(zhuǎn)速攪拌半個(gè)小時(shí)再去離心。 |
4樓2012-08-10 16:34:02
5樓2012-08-10 17:24:31
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6樓2012-08-10 20:44:17
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7樓2012-08-10 20:45:32
8樓2012-08-11 09:21:56
9樓2012-08-11 09:25:40
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