 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 5 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 6189 | 回復(fù): 12 | ||||
| 本帖產(chǎn)生 1 個(gè) MolEPI ，點(diǎn)擊這里進(jìn)行查看 | ||||
| 當(dāng)前只顯示滿足指定條件的回帖，點(diǎn)擊這里查看本話題的所有回帖 | ||||
[求助]
硫酸銨沉淀的一些問題，求高手幫忙看一下！
|
||||
|
最近在做一種真菌胞外酶的分離，不知道蛋白的具體的性質(zhì)，文獻(xiàn)報(bào)道的種類也比較多。不過大部分都采用硫酸銨沉淀后，再過柱子。 我選擇加入固體硫酸銨（考慮到發(fā)酵液大量，加入液體體積太大了），發(fā)酵液離心去沉淀，濾紙抽濾3次，加入EDTA（終濃度為1mM），發(fā)酵液的蛋白含量在10ug/ml左右，做80%的硫酸銨沉淀，全程操作在冰水上進(jìn)行。 在《蛋白技術(shù)手冊(cè)》中，提及加入硫酸銨的時(shí)間再10-20min之內(nèi)，但是又強(qiáng)調(diào)必須等硫酸銨晶體溶解完之后加。我640ml的發(fā)酵液，盡量保證溶解之后再加，總共用了四個(gè)小時(shí)才加完。 之前的預(yù)實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)格保證硫酸銨溶解完之后加，總共用了四天時(shí)間（每天加10個(gè)多小時(shí)）。 兩次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相差不大，復(fù)性之后都損失了將近95%的蛋白，比酶活也下降非常多。在加入硫酸銨的過程中，花費(fèi)四小時(shí)的實(shí)驗(yàn)，出現(xiàn)了大量的白色泡沫（蛋白變性的結(jié)果），花費(fèi)四天的實(shí)驗(yàn)中泡沫則要少一些。兩次實(shí)驗(yàn)中，收集沉淀，混溶然后離心，有一半都是不溶固體（在加入硫酸銨后，有大量的絮狀沉淀出現(xiàn)，應(yīng)該是這些物質(zhì)）。 有這樣幾個(gè)問題 1：不知道硫酸銨的加入時(shí)間以及加入速度，到底是怎么樣的？有過相關(guān)經(jīng)驗(yàn)的同學(xué)能不能給個(gè)參考~~~（這實(shí)驗(yàn)一直失敗，關(guān)于這個(gè)問題各種凌亂...） 2：硫酸銨沉淀這種方法對(duì)于蛋白濃度要求最好是1mg/ml，但是我發(fā)酵液蛋白濃度本來就極低，原來就想通過硫酸銨沉淀得到濃縮液的，實(shí)驗(yàn)失敗是不是與我濃度低有關(guān)？ PS：也想過其它的方法，譬如聚乙二醇吸水（我將近1L的發(fā)酵液，所用的量實(shí)在太大了...），超濾沒有相關(guān)設(shè)備，原核表達(dá)的話，估計(jì)又要做個(gè)半年一年的了。實(shí)驗(yàn)卡這里超過兩個(gè)月了，各種糾結(jié)啊~~ [ Last edited by cc1000ml on 2012-8-10 at 11:42 ] |
回復(fù)此樓» 收錄本帖的淘帖專輯推薦
 【分子生物】EPI帖 | 蛋白表達(dá)純化鑒定精華 |
» 猜你喜歡
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之小鼠實(shí)驗(yàn)：嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計(jì)，解析生命機(jī)制的重要載體
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之重金屬檢測(cè)：精準(zhǔn)篩查，守護(hù)健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤(rùn)色/翻譯怎么收費(fèi)?
已經(jīng)有75人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“蛙測(cè)重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標(biāo)南京
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
留學(xué)--博士招生
已經(jīng)有16人回復(fù)
-
化學(xué)工程，本211，求調(diào)劑，ab區(qū)不限
已經(jīng)有4人回復(fù)
-
邵陽學(xué)院食品與化學(xué)工程學(xué)院碩士調(diào)劑
已經(jīng)有0人回復(fù)
» 本主題相關(guān)價(jià)值貼推薦，對(duì)您同樣有幫助:
- 硫酸銨沉淀后我的目的蛋白含量沒有明顯增多，怎么回事��？？？？？？？？？？？
已經(jīng)有4人回復(fù)
- 硫酸銨沉淀目的蛋白的疑惑
已經(jīng)有5人回復(fù)
- 求助硫酸銨沉淀法配比用表
已經(jīng)有4人回復(fù)
- 急�。。。∫嘿|(zhì)圖譜超詭異~~~不知道是不是被污染了 ~~~求高手幫忙看一下
已經(jīng)有21人回復(fù)
- 硫酸銨沉淀脂肪酶的問題
已經(jīng)有5人回復(fù)
- 求助硫酸銨沉淀蛋白質(zhì)的問題
已經(jīng)有12人回復(fù)
- 硫酸銨沉淀蛋白質(zhì)
已經(jīng)有16人回復(fù)
- 硫酸銨沉淀后透析，里面的沉淀是什么？
已經(jīng)有6人回復(fù)
- 【求助/交流】急求關(guān)于硫酸銨沉淀
已經(jīng)有3人回復(fù)
- 【求助/交流】硫酸銨沉淀蛋白
已經(jīng)有12人回復(fù)
- 【求助/交流】請(qǐng)問哪位懂硫銨沉淀，給點(diǎn)經(jīng)驗(yàn)！
已經(jīng)有6人回復(fù)
- 【求助】硫酸銨pH的問題
已經(jīng)有5人回復(fù)
- 【求助/交流】關(guān)于硫酸銨沉淀的問題
已經(jīng)有7人回復(fù)
- 【求助/交流】硫酸銨沉淀蛋白
已經(jīng)有6人回復(fù)
- 【求助/交流】硫酸銨分級(jí)沉淀
已經(jīng)有13人回復(fù)
- 【求助】硫酸銨沉淀
已經(jīng)有9人回復(fù)
|
幾點(diǎn)疑問 1：如果按照640ml的發(fā)酵液，到80%濃度，需要硫酸銨飽和溶液將近500ml，體積幾乎是翻倍了。如果加入500ml飽和溶液，那么滴加速度該如何控制呢？（如果加入固體會(huì)有明顯晶體可以看得到，可以作為一個(gè)快慢標(biāo)準(zhǔn).） 2：再者是一個(gè)過程總共需要多少時(shí)間的問題，因?yàn)槟莻�(gè)手冊(cè)中明確說明要在10-30min內(nèi)加完，所以我個(gè)人覺得加硫酸銨的時(shí)間應(yīng)該是一個(gè)比較重要的因素.不知道您是怎樣看這個(gè)問題的。 3：關(guān)于絮狀沉淀和泡沫的問題。 我在加入過程中也是使用磁力攪拌機(jī)，，氣泡之所以很多而且聚集的原因主要是蛋白變性，使溶液粘度增加，攪拌產(chǎn)生的氣泡難以破碎。氣泡應(yīng)該是蛋白變性的一個(gè)表現(xiàn)。 絮狀沉淀是在加完硫酸銨之后，靜止一小時(shí)后可以看得到的，在剛加完的時(shí)候也是一種比較均一的懸濁液。 十分感謝您的回復(fù)~~~ |
3樓2012-08-10 15:40:28
dshlove
木蟲 (正式寫手)
- MolEPI: 17
- 應(yīng)助: 237 (大學(xué)生)
- 金幣: 4764.7
- 散金: 20
- 紅花: 10
- 帖子: 852
- 在線: 419.2小時(shí)
- 蟲號(hào): 1609389
- 注冊(cè): 2012-02-10
- 性別: GG
- 專業(yè): 污染控制化學(xué)
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+3, MolEPI+1, 鼓勵(lì)積極應(yīng)助，解答問題 2012-08-10 14:31:38
cc1000ml: 金幣+5, ★有幫助, 感謝回帖~~ 2012-08-10 15:42:06
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+3, MolEPI+1, 鼓勵(lì)積極應(yīng)助，解答問題 2012-08-10 14:31:38
cc1000ml: 金幣+5, ★有幫助, 感謝回帖~~ 2012-08-10 15:42:06
|
我覺得你的操作太費(fèi)時(shí)間了。 其實(shí)，640ml的體積對(duì)生產(chǎn)來說已經(jīng)很小了，所以，我的建議是先將硫酸銨配置成飽和溶液，然后算好要加的體積量，用蠕動(dòng)泵滴加。同時(shí)用小轉(zhuǎn)子攪拌，速度要慢。這樣就能得到比較均一的乳狀懸濁液。不會(huì)出現(xiàn)你說的絮狀沉淀還有泡沫了，再離心取沉淀。再做下一步處理。 固體硫酸銨加入到發(fā)酵液你還要不斷攪拌，會(huì)產(chǎn)生很多泡沫，蛋白變性就無法避免了，而且，固體會(huì)導(dǎo)致局部濃度過高，形成絮狀沉淀。配置飽和溶液就能解決了。 |
2樓2012-08-10 14:16:18
dshlove
木蟲 (正式寫手)
- MolEPI: 17
- 應(yīng)助: 237 (大學(xué)生)
- 金幣: 4764.7
- 散金: 20
- 紅花: 10
- 帖子: 852
- 在線: 419.2小時(shí)
- 蟲號(hào): 1609389
- 注冊(cè): 2012-02-10
- 性別: GG
- 專業(yè): 污染控制化學(xué)
【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★ ★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
cc1000ml: 金幣+5, ★有幫助, 多謝回帖~ 2012-08-10 17:22:30
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
cc1000ml: 金幣+5, ★有幫助, 多謝回帖~ 2012-08-10 17:22:30
|
針對(duì)你的問題，我就自己知道的回答下： 1：滴加的速度基本就是一秒一到兩滴的速度，當(dāng)然你可以按照蛋白的要求，在某一規(guī)定時(shí)間內(nèi)全部加進(jìn)去。 2：其實(shí)手冊(cè)說明只是一個(gè)大概的，一般蛋白55%情況下就能沉淀差不多了，85%能獲得最大量，所以你要結(jié)合你的蛋白，在不產(chǎn)生局部沉淀情況下盡量快。但是，我覺得加的時(shí)間不是一個(gè)特別重要的因素，我覺得濃度才是比較重要的，畢竟沉淀過程其實(shí)也是一個(gè)去雜和富集的過程。 3：產(chǎn)生氣泡，說明你攪拌得太劇烈了。攪拌必須是有規(guī)則和溫和的。粘度增加可能不是蛋白的原因，也有可能是核酸太多了。氣泡有時(shí)候可以在樣品里補(bǔ)點(diǎn)NaCl，可以消泡的。 加完硫酸銨之后為什么要靜置��？可以用轉(zhuǎn)子低轉(zhuǎn)速攪拌半個(gè)小時(shí)再去離心。 |
4樓2012-08-10 16:34:02
5樓2012-08-10 17:24:31
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 070305高分子化學(xué)與物理 304分求調(diào)劑 +12 | c297914 2026-03-28 | 12/600 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 070300化學(xué)354求調(diào)劑 +6 | 101次希望 2026-03-28 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 343求調(diào)劑 +6 | 愛羈絆 2026-03-29 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 348求調(diào)劑 +5 | 小懶蟲不懶了 2026-03-28 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 0856求調(diào)劑 +7 | 楒桉 2026-03-28 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑 +7 | 爭(zhēng)取九點(diǎn)睡 2026-03-28 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 312，生物學(xué)求調(diào)劑 +3 | 小譯同學(xué)abc 2026-03-28 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 材料求調(diào)劑一志愿哈工大324 +7 | 閆旭東 2026-03-28 | 9/450 |
|
|
|
[考研]
 材料與化工考研調(diào)劑
+17
|
孅華 2026-03-22 | 17/850 |
|
|
|
[考研] 315分求調(diào)劑 +7 | 26考研上岸版26 2026-03-26 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 070300化學(xué)求調(diào)劑 +4 | 起個(gè)名咋這么難 2026-03-27 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 安徽大學(xué)專碩生物與醫(yī)藥專業(yè)(086000)324分，英語已過四六級(jí)，六級(jí)521，求調(diào)劑 +4 | 美味可樂雞翅 2026-03-26 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 274求調(diào)劑 +17 | 顧九笙要謙虛 2026-03-24 | 23/1150 |
|
|
|
[考研] 085600材料與化工調(diào)劑 +10 | A-哆啦Z夢(mèng) 2026-03-23 | 16/800 |
|
|
|
[考研] 315調(diào)劑 +4 | 0860求調(diào)劑 2026-03-26 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 081200-11408-276學(xué)碩求調(diào)劑 +4 | 崔wj 2026-03-26 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 343求調(diào)劑 +4 | 贈(zèng)我一本書 2026-03-23 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 351求調(diào)劑 +4 | 麥克阿磊 2026-03-24 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 281求調(diào)劑 +6 | Koxui 2026-03-24 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 考研一志愿蘇州大學(xué)初始315（英一）求調(diào)劑 +3 | sbdksD 2026-03-24 | 4/200 |
|