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傻子木蟲 (正式寫手)
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【求助】哪位用TRI zol法提過櫻花的總RNA?
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| 用TRI zol法提過幾次櫻花和櫻桃的總RNA都沒提出來。哪位提過的，能不能提供一下方法? |
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2樓2007-05-22 17:13:21
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1. 勻漿處理：將組織在液氮中磨碎，100mg加入1ml TRIzol。 2．將樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘。 3．4℃12000rpm離心10分鐘，取上清。 4．加入0.3ml氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。 5．4℃12000rpm離心10分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中。 6．把水相轉(zhuǎn)移到新管中，加入0.5ml異丙醇【多糖樣品加入0.25ml異丙醇和0.25ml高鹽溶液(0.8M檸檬酸鈉和1.2M NaCl)】-20℃放置20分鐘。 7．4℃15000rpm離心10分鐘，移去上清。 8．用1ml 75℅乙醇洗滌RNA沉淀，使沉淀懸浮。4℃ 8000rpm離心5分鐘，棄上清。 9．室溫放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大約晾5-10分鐘，加入40μl DEPC水，用槍頭吸打幾次，-70℃保存。 我是按這個(gè)步驟做的，其他的樣品如煙草、番茄可以提的出來，但是櫻花、櫻桃、桃子都提不出來。 |
3樓2007-05-22 23:44:08
4樓2007-05-23 19:01:18
johnsooh
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5樓2007-05-23 23:19:56
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6樓2007-05-24 00:51:22
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7樓2007-05-24 00:52:42
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如果你是提含糖量高的，下面是一個(gè)方法，僅供參考，你可以根據(jù)他的介紹修改你的試驗(yàn) 從富含多糖的植物組織中提取和純化RNA 從植物組織中提取高質(zhì)、高產(chǎn)的RNA比較困難,這主要因?yàn)樵诩?xì)胞裂解過程中，自發(fā)形成多糖和/或多聚酚，這些物質(zhì)在組織抽提時(shí)與核酸形成復(fù)合物，并在后來的乙醇沉淀階段共同沉淀下來。根據(jù)這些污染物的量和性質(zhì)，所得的乙醇沉淀物可能是凝膠狀的，并難于溶解。受多糖和/或多聚苯酚污染的RNA溶液很粘，并且在230 nm有強(qiáng)烈吸收。這種紫外吸收影響A260 對RNA含量的精確定量。而且污染的RNA不適于進(jìn)行cDNA分析，反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增，體外翻譯，或Northern 分析。生長在不同環(huán)境條件下的不同物種和相同物種，成功分離RNA的條件有顯著的差異。將植物暴露于高濃度CO2常導(dǎo)致整個(gè)葉子糖類大量的增加，尤其是淀粉和多糖。因此在高濃度CO2環(huán)境中生長植物的RNA分離，碳水化合物的污染問題更突出。植物組織一般用SDS/苯酚或硫氰酸胍提取RNA。為了克服多聚苯酚和/或多糖污染的問題，一些人用諸如氯化銫梯度沉淀或不同溶劑沉淀。然而在去除污染時(shí)，這些方法并非總是有效。因此需要建立簡單、可信、廉價(jià)的方法提取干凈高效的RNA。下面介紹硫氰酸胍提取方法，硫氰酸胍能溶解細(xì)胞并使蛋白變性，當(dāng)用于抽提緩沖液時(shí)，可產(chǎn)生無RNase的環(huán)境。組織抽提后，以中等轉(zhuǎn)速離心勻漿液，以除去不溶性多糖。用苯酚/氯仿將上清液抽提出，RNA位水相，DNA和蛋白質(zhì)位于苯酚相和兩相交界面。用醋酸鉀將位于水相的多糖選擇性的沉淀出來。然后用氯化鋰選擇性將RNA從殘余的污染物中純化出來。該方法成功從多種在高濃度CO2環(huán)境中生長的植物中提取了葉子RNA，證明了該方法的有效性。 （一）材料與設(shè)備 1. 0.75mol/L 檸檬酸鈉，pH 7.0 (含檸檬酸)。用0.1% DEPC處理并高壓滅菌。 2. 10% (w/v) N-月桂肌氨酸（N-lauroyl sarcosine）。 3. 硫氰酸胍緩沖液：用293 ml無菌去離子水，17.6ml 0.75 mol/L 檸檬酸鈉，26.4ml 10% N-十二醇肌氨酸鈉，在廠家藥瓶內(nèi)于65℃溶解250g 硫氰酸胍（不用稱重）。 4. 抽提緩沖液：每5ml 硫氰酸胍緩沖液加36µl 巰基乙醇。若被提取組織含多聚苯酚，抽提緩沖液中可加入聚乙烯聚吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrolidone）(20% w/w)。 5. 氯仿/異戊醇49：1（v/v）。 6. 2 mol/L 醋酸鈉，加乙酸至pH 4.0 。 7. 酸性苯酚：500g 晶體苯酚溶于500ml去離子水中，50ml每份于－20℃保存，4℃可保存一個(gè)月。 8. 異丙醇。 9. 70%和100%乙醇。 10. 2 mol/L 醋酸鉀，加冰醋酸至pH 4.8。 11. 1O mol/L LiC1。 12. TNE 緩沖液：10mmol/L Tris-HC1, pH 7.5, 室溫, 150mmol/L NaC1, 1 mmol/L EDTA。 13. TE 緩沖液：10mmol/L Tris-HC1, pH 7.5, 1mmol/L EDTA。 14. 研缽和研杵。 15. 液氮。 16. 離心機(jī)。 17. 玻璃Pasteur 吸量管，200℃干烤至少3小時(shí)。 （二）操作方法 1. 在液氮中將0.4g 組織研磨為細(xì)粉末，勿讓組織解凍。 2. 在研磨過程中，加入3.5ml抽提緩沖液，充分研磨。將勻漿轉(zhuǎn)移到一個(gè)10ml聚丙烯管。用1ml抽提緩沖液沖洗研杵和研缽，然后移至聚丙烯管中。 3. 23000g，4℃，離心20 分鐘。 4. 用烤過的玻璃吸量管將上層懸浮液移入10ml 聚丙烯管。 5. 加0.4ml 2mol/L 醋酸鈉，混合混勻。加4ml苯酚，混勻。加0.8ml氯仿/異戊醇，混勻。 6. 聚丙烯管置于冰上 15 分鐘。 7. 離心，方法如步驟3。 8. 用烤過的玻璃吸量管將上層懸浮液移入30ml 聚丙烯管，加入同樣容積的 2mol/L 醋酸鉀，混合混勻。 9. 聚丙烯管置于冰上至少30 分鐘。 10. 44000g，4℃離心20 分鐘。 11. 將上清液移入15ml 聚丙烯管，加0.6-1 倍體積的100%的冰異丙醇，混勻，-20℃ 放置45 分鐘。 12. 以2700g，于4℃離心20 分鐘。 13. 輕輕倒出上清液，用1ml 70% 乙醇洗滌沉淀，如步驟12離心3 分鐘，盡可能將乙醇倒凈。 14. 加入400µl DEPC 處理的水溶解沉淀，移至1.5ml管中。 15. 加100µl 10mol/L LiC1, 4℃ 放置至少2 h。 16. 12000g，4℃離心20 分鐘 。 17. 用1ml 70% 乙醇洗滌沉淀兩次。 18. 加入200µl TNE 重懸沉淀，再加500µl 100% 乙醇，-20℃ 放置至少15 分鐘。 19. 如步驟16離心5分鐘 。 20. 用1ml 70% 乙醇洗滌沉淀兩次。 21. 加入200-400µl TE 重懸沉淀。 22. 將每個(gè)樣本稀釋30-50倍，在 230nm，260nm，280nm測量吸光度。 （三）注意事項(xiàng) 1. 開始的離心去除了大部分不溶性多聚糖，如淀粉顆粒。殘余的組織在管的底部形成暗綠色沉淀（若用的是葉子），不溶性多糖在殘余組織上面形成灰白色膠狀層。 2. 當(dāng)吸取上清液時(shí)，應(yīng)十分小心，勿攪亂膠狀沉淀，因?yàn)樵搶臃浅＼�。上清液的體積大約4 ml，若因沉淀多而使體積明顯不足時(shí)，用抽提緩沖液補(bǔ)足。 3. 加入乙酸鉀后，延長孵育時(shí)間（達(dá)30 分鐘）會提高 RNA 的質(zhì)量，尤其出現(xiàn)蛋白污染時(shí)。多糖形成灰白色膠狀沉淀。若所用的組織多糖含量高，延長孵育時(shí)間（至60 分鐘）也有助于沉淀更多的多糖。 4. 加入異丙醇后，不應(yīng)看到沉淀，任何可見的沉淀表明大量多糖的存在。孵育時(shí)間大于60 分鐘，就會形成多糖沉淀。 5. RNA 沉淀應(yīng)為白色，若有灰白色膠狀沉淀則為多糖污染。遇到該情況，將沉淀再懸浮于200µl TE，加1倍體積的2mol/L 醋酸鉀，冰上孵育30 分鐘。12,000g ，4℃離心 20 分鐘。將上清液移至一新1.5ml 管中，用2.5 倍體積的100% 乙醇沉淀RNA，-20℃，15 分鐘. 繼續(xù)方法中的步驟16。 6. 判斷RNA分離的成功與否，測量在230，260，280nm處的紫外吸收可以評估RNA的產(chǎn)量和質(zhì)量。若A260／230值小于2，則表明多糖和/或多聚苯酚污染；若A260:A280比值小于1.7，表明蛋白污染。在瓊脂糖凝膠上出現(xiàn)的28S和18S rRNA，可用以評估RNA的完整性。 7. 該方法提取的RNA適于poly(A)＋的分離，Northern 分析，cDNA 分析，RT-PCR擴(kuò)增。 參考文獻(xiàn) 1. Lopez-Gomez, R. and Gomez-Lim, M. A. A method for extracting intact RNA from fruits rich in polysaccharides using ripe Mango mesocarp. HortScience,1992,27: 440-442. 2. Mitra, D. and Kootstra, A. Isolation of RNA from apple skin. Plant Mol.Biol. Reptr. 1993,11:326-332. 3. Newbury, H. J. and Possingham, J. V.. Factors affecting the extraction of intact ribonucleic acid from plant tissues containing interfering phenolic compounds. Plant Physiol. 1977,60: 543-547. 4. Schultz, D. J., Craig, R., Cox-Foster,et al. RNA isolation from recalcitrant plant tissue. Plant Mol. Biol. Reptr. 1994, 12: 310-316. 5. Wang, C.-S. and Vodkin L. O. Extraction of RNA from tissues containing high levels of procyanidins that bind RNA. Plant Mol. Biol. Reptr. 1994, 12: 132-145. 6. Lay-Yee, M., DellaPenna, D., and Ross, G. S. Changes in mRNA and protein during ripening of apple fruit (Malus domestica Borkh. cv. Golden Delicious). Plant Physiol. 1990,94: 850-853. 7. Tesniere, C. and Vayda, M. E. Method for the isolation of high-quality RNA from grape berry tissues without contaminating tannins or carbohydrates. Plant Mol. Biol. Repth, 1991,9: 242-251. 8. Chomczynski, P. and Sacchi, N. Single-step methods of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 1987,162: 156-159. 9. Glisin, V., Crkvenjakov, R., and Byus, C. Ribonucleic acid isolated by cesium chloride centrifugation. Biochemistry, 1974,13: 2633-2637. 10. Manning, K. Isolation of nucleic acids from plants by differential solvent precipitation. Anal. Biochem. 1991,195: 45-50. 11. Ainsworth, C. Isolation of RNA from floral tissue of Rumex acetosa (sorrel). Plant Mol. Biol. Reptr. 1994, 12: 198-203. [ Last edited by telomerase on 2007-5-24 at 10:32 ] |
8樓2007-05-24 10:30:49
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