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[求助]
通過溫敏質粒構建鏈球菌基因缺失
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請求研究相關方向的前輩幫助: 小弟去年開始做鏈球菌基因敲出試驗的,使用的是溫敏穿梭載體,通過融合PCR將上游同源臂(1000bp),抗性基因(CAT),下游同源臂(800bp)連在一起,電轉化后按照之前的文獻報道的氯霉素抗性濃度進行篩選,具體篩選方式如下: 1,通過28度+穿梭載體上抗性基因的抗生素,肉湯里傳代2次; 2,通過37度+穿梭載體上抗性基因的抗生素,肉湯里傳代3次; 3,通過28度+不加任何抗生素,肉湯里傳代5次; 4,將無抗傳代5次的菌液普于含氯霉素(5μg/ml)的抗性平板上,28度培養(yǎng)兩天; 這個方法是參考外文里的方法做的,但是我做了將近兩個月還是沒有在氯霉素平板上看見什么長出,不知道方法有沒有問題,懇請研究相關方向的前輩指點. 還有就是我的氯霉素抗性基因是660bp,剛好是cat的CDS區(qū),我之前看其他人用其他載體做缺失時都在抗性基因前面加入了一個啟動子,不知道這個有沒有影響.對于做缺失是不是一定要加啟動子或者在那種情況下架啟動子,我很茫然,希望各位前輩能提供寶貴意見! |
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