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[求助]
通過(guò)溫敏質(zhì)粒構(gòu)建鏈球菌基因缺失
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請(qǐng)求研究相關(guān)方向的前輩幫助: 小弟去年開(kāi)始做鏈球菌基因敲出試驗(yàn)的,使用的是溫敏穿梭載體,通過(guò)融合PCR將上游同源臂(1000bp),抗性基因(CAT),下游同源臂(800bp)連在一起,電轉(zhuǎn)化后按照之前的文獻(xiàn)報(bào)道的氯霉素抗性濃度進(jìn)行篩選,具體篩選方式如下: 1,通過(guò)28度+穿梭載體上抗性基因的抗生素,肉湯里傳代2次; 2,通過(guò)37度+穿梭載體上抗性基因的抗生素,肉湯里傳代3次; 3,通過(guò)28度+不加任何抗生素,肉湯里傳代5次; 4,將無(wú)抗傳代5次的菌液普于含氯霉素(5μg/ml)的抗性平板上,28度培養(yǎng)兩天; 這個(gè)方法是參考外文里的方法做的,但是我做了將近兩個(gè)月還是沒(méi)有在氯霉素平板上看見(jiàn)什么長(zhǎng)出,不知道方法有沒(méi)有問(wèn)題,懇請(qǐng)研究相關(guān)方向的前輩指點(diǎn). 還有就是我的氯霉素抗性基因是660bp,剛好是cat的CDS區(qū),我之前看其他人用其他載體做缺失時(shí)都在抗性基因前面加入了一個(gè)啟動(dòng)子,不知道這個(gè)有沒(méi)有影響.對(duì)于做缺失是不是一定要加啟動(dòng)子或者在那種情況下架啟動(dòng)子,我很茫然,希望各位前輩能提供寶貴意見(jiàn)! |
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3樓2015-09-23 14:29:29
如在還在
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2樓2013-07-30 15:01:06
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