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lushuiw銀蟲 (正式寫手)
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[求助]
激光掃描共聚焦顯微鏡
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| 我想用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察果肉細(xì)胞中的鈣離子，樣品采回來(lái)，該咋處理？ |
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lushuiw
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4樓2012-08-19 21:18:14
lushuiw
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2樓2012-08-19 16:55:52
ll9999
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3樓2012-08-19 19:06:40
【答案】應(yīng)助回帖
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三.動(dòng)態(tài)測(cè)量 l Physiology:細(xì)胞內(nèi)離子動(dòng)態(tài)變化測(cè)量 1).游離Ca2+測(cè)量 檢測(cè)游離Ca2+變化熒光探針的原理：這類探針多為Ca2+螯合劑，不與Ca2+結(jié)合時(shí)不發(fā)熒光，通常也不能進(jìn)入細(xì)胞膜，只有與乙酰甲酯AM相連方可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，被細(xì)胞內(nèi)酯酶水解后并與胞內(nèi)游離鈣結(jié)合后發(fā)出熒光。Kd值為Ca2+解離常數(shù)，表明檢測(cè)Ca2+濃度的范圍:0.1xKd-10xkd, Kd和很多因素有關(guān)，如pH、 Mg2+、與蛋白的結(jié)合、溫度等。細(xì)胞內(nèi)生理Ca2+濃度值(10-100n M)，細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載濃度值（基礎(chǔ)Ca2+濃度的10倍左右） 熒光探針 激發(fā)波長(zhǎng) 發(fā)射波長(zhǎng) Kd FLuo3-AM, K+, dextran 506nm 525nm 390nM Fluo4 506nm 525nm Calcium Green-1 507nm 530nm 190nM Calcium Green-2 507nm 535nm 550nM Fura red 420/480nm 637nm 140nM Oregon Green 488 494nm 520nm 20,000nM Calcium Crimson 583nm 602nm 328nM Indo-1 356nm 405/458nm 230nM Fura-2 340/380 476nm 145nM l 相對(duì) 測(cè)量 DF/F=(F-Fbase)/(Fbase-FBG) l Ca2+濃度絕對(duì)測(cè)量 l 單波長(zhǎng)公式法 Fluo3: 530nm Kd=450nM [Ca2+]I =Kd(F-Fmin)/(Fmax-F) Fmin: 細(xì)胞內(nèi)無(wú)鈣時(shí)的熒光強(qiáng)度( MnCl2) Fmax：細(xì)胞內(nèi)鈣飽和時(shí)的熒光強(qiáng)度(A23187) • 測(cè)量時(shí)切記細(xì)胞內(nèi)靜息Ca2+濃度的相對(duì)熒光強(qiáng)度值不能太低（F值不低于40） 細(xì)胞內(nèi)生理Ca2+濃度值（10-8 -10-7 M） 細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載濃度值（基礎(chǔ)Ca2+濃度的10倍左右） • 標(biāo)準(zhǔn)曲線法 根據(jù)儀器條件和負(fù)載條件，以不同Ca2+濃度的Buffer(EGTA- Ca2+)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫軸為Ca2+濃度，縱軸為熒光強(qiáng)度 • 比例熒光的測(cè)量 .雙波長(zhǎng)(比例熒光：ratio) Indo1(360, 420/480), fura2(340/380, 440) [Ca2+]I =Kd(R-Rmin)/(Rmax-R)Ff2/Fs2 • 細(xì)胞器的Ca2+測(cè)量 1.線粒體內(nèi)游離Ca2+測(cè)量 Fluo-3 + TMRM(線粒體熒光探針，紅色） 2. 特異定位的重組水母發(fā)光蛋白 水母發(fā)光蛋白與 Ca2+結(jié)合后發(fā)藍(lán)光 用含有水母發(fā)光蛋白和含有特定細(xì)胞器蛋白的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，可測(cè)定亞細(xì)胞器內(nèi)的游離Ca2+變化 目前已商品化的探針可檢測(cè)：線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞核內(nèi)的游離Ca2+，因生物發(fā)光很弱不能使用Confocal檢測(cè) 細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+測(cè)量的應(yīng)用 l 鈣的特性 1．細(xì)胞內(nèi)外的電化學(xué)梯度103-104倍 2．細(xì)胞膜滲透性稍有改變或鈣庫(kù)釋放稍有增加，導(dǎo)致胞內(nèi)鈣 明顯升高 3．細(xì)胞內(nèi)鈣為細(xì)胞激活“開關(guān)” l 細(xì)胞內(nèi)鈣的生理作用 1．肌肉的興奮收縮-收縮偶聯(lián) 2．神經(jīng)遞質(zhì)的釋放 3．學(xué)習(xí)記憶的增強(qiáng) 4．卵子受精 5．細(xì)胞分裂和再生 6．細(xì)胞調(diào)亡 7．細(xì)胞間通訊 8．細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo) 9. DNA合成 10. 基因表達(dá) l 細(xì)胞內(nèi)鈣超載與疾病 1．高血壓、腦缺血、心臟病、內(nèi)分泌病—胞內(nèi)鈣濃度異常 2．糖尿病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化病—胞內(nèi)鈣濃度增高 3．人體缺鈣—骨鈣大量丟失，神經(jīng)細(xì)胞的鈣濃度增高 4．老化和老年性癡呆-神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度增高 細(xì)胞內(nèi)生理Ca2+濃度值（10-8 -10-7 M） 細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載濃度值（基礎(chǔ)Ca2+濃度的10倍左右） 五.熒光漂白恢復(fù)(FRAP: Fluorescence Recover after photobleaching） 定義:經(jīng)熒光探針標(biāo)記的細(xì)胞的某一區(qū)域一旦被高強(qiáng)度的 激光照射后,熒光物質(zhì)的光化學(xué)結(jié)構(gòu)被迫壞,熒光強(qiáng)度 下降, 且為不可逆的過(guò)程, 但此處熒光強(qiáng)度會(huì)漸漸恢 復(fù), 熒光強(qiáng)度和恢復(fù)的快慢和多少,代表周圍分子擴(kuò)散 的速率, 或分子運(yùn)動(dòng)速度。 R=(I2-I1 /I0-I2)´100% R-熒光漂白恢復(fù)率：代表分子的運(yùn)動(dòng)速度 應(yīng)用：細(xì)胞間通訊， 細(xì)胞膜流動(dòng)性，蛋白分子的運(yùn)動(dòng) |
5樓2012-08-19 22:19:49
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