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lushuiw銀蟲 (正式寫手)
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[求助]
激光掃描共聚焦顯微鏡
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| 我想用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察果肉細胞中的鈣離子，樣品采回來，該咋處理？ |
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【答案】應助回帖
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三.動態(tài)測量 l Physiology:細胞內(nèi)離子動態(tài)變化測量 1).游離Ca2+測量 檢測游離Ca2+變化熒光探針的原理：這類探針多為Ca2+螯合劑，不與Ca2+結(jié)合時不發(fā)熒光，通常也不能進入細胞膜，只有與乙酰甲酯AM相連方可進入細胞內(nèi)，被細胞內(nèi)酯酶水解后并與胞內(nèi)游離鈣結(jié)合后發(fā)出熒光。Kd值為Ca2+解離常數(shù)，表明檢測Ca2+濃度的范圍:0.1xKd-10xkd, Kd和很多因素有關(guān)，如pH、 Mg2+、與蛋白的結(jié)合、溫度等。細胞內(nèi)生理Ca2+濃度值(10-100n M)，細胞內(nèi)Ca2+超載濃度值（基礎Ca2+濃度的10倍左右） 熒光探針 激發(fā)波長 發(fā)射波長 Kd FLuo3-AM, K+, dextran 506nm 525nm 390nM Fluo4 506nm 525nm Calcium Green-1 507nm 530nm 190nM Calcium Green-2 507nm 535nm 550nM Fura red 420/480nm 637nm 140nM Oregon Green 488 494nm 520nm 20,000nM Calcium Crimson 583nm 602nm 328nM Indo-1 356nm 405/458nm 230nM Fura-2 340/380 476nm 145nM l 相對 測量 DF/F=(F-Fbase)/(Fbase-FBG) l Ca2+濃度絕對測量 l 單波長公式法 Fluo3: 530nm Kd=450nM [Ca2+]I =Kd(F-Fmin)/(Fmax-F) Fmin: 細胞內(nèi)無鈣時的熒光強度( MnCl2) Fmax：細胞內(nèi)鈣飽和時的熒光強度(A23187) • 測量時切記細胞內(nèi)靜息Ca2+濃度的相對熒光強度值不能太低（F值不低于40） 細胞內(nèi)生理Ca2+濃度值（10-8 -10-7 M） 細胞內(nèi)Ca2+超載濃度值（基礎Ca2+濃度的10倍左右） • 標準曲線法 根據(jù)儀器條件和負載條件，以不同Ca2+濃度的Buffer(EGTA- Ca2+)做標準曲線，橫軸為Ca2+濃度，縱軸為熒光強度 • 比例熒光的測量 .雙波長(比例熒光：ratio) Indo1(360, 420/480), fura2(340/380, 440) [Ca2+]I =Kd(R-Rmin)/(Rmax-R)Ff2/Fs2 • 細胞器的Ca2+測量 1.線粒體內(nèi)游離Ca2+測量 Fluo-3 + TMRM(線粒體熒光探針，紅色） 2. 特異定位的重組水母發(fā)光蛋白 水母發(fā)光蛋白與 Ca2+結(jié)合后發(fā)藍光 用含有水母發(fā)光蛋白和含有特定細胞器蛋白的表達載體轉(zhuǎn)染細胞，可測定亞細胞器內(nèi)的游離Ca2+變化 目前已商品化的探針可檢測：線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細胞核內(nèi)的游離Ca2+，因生物發(fā)光很弱不能使用Confocal檢測 細胞內(nèi)游離Ca2+測量的應用 l 鈣的特性 1．細胞內(nèi)外的電化學梯度103-104倍 2．細胞膜滲透性稍有改變或鈣庫釋放稍有增加，導致胞內(nèi)鈣 明顯升高 3．細胞內(nèi)鈣為細胞激活“開關(guān)” l 細胞內(nèi)鈣的生理作用 1．肌肉的興奮收縮-收縮偶聯(lián) 2．神經(jīng)遞質(zhì)的釋放 3．學習記憶的增強 4．卵子受精 5．細胞分裂和再生 6．細胞調(diào)亡 7．細胞間通訊 8．細胞信號傳導 9. DNA合成 10. 基因表達 l 細胞內(nèi)鈣超載與疾病 1．高血壓、腦缺血、心臟病、內(nèi)分泌病—胞內(nèi)鈣濃度異常 2．糖尿病、風濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化病—胞內(nèi)鈣濃度增高 3．人體缺鈣—骨鈣大量丟失，神經(jīng)細胞的鈣濃度增高 4．老化和老年性癡呆-神經(jīng)細胞內(nèi)鈣濃度增高 細胞內(nèi)生理Ca2+濃度值（10-8 -10-7 M） 細胞內(nèi)Ca2+超載濃度值（基礎Ca2+濃度的10倍左右） 五.熒光漂白恢復(FRAP: Fluorescence Recover after photobleaching） 定義:經(jīng)熒光探針標記的細胞的某一區(qū)域一旦被高強度的 激光照射后,熒光物質(zhì)的光化學結(jié)構(gòu)被迫壞,熒光強度 下降, 且為不可逆的過程, 但此處熒光強度會漸漸恢 復, 熒光強度和恢復的快慢和多少,代表周圍分子擴散 的速率, 或分子運動速度。 R=(I2-I1 /I0-I2)´100% R-熒光漂白恢復率：代表分子的運動速度 應用：細胞間通訊， 細胞膜流動性，蛋白分子的運動 |
5樓2012-08-19 22:19:49
lushuiw
銀蟲 (正式寫手)
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2樓2012-08-19 16:55:52
ll9999
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3樓2012-08-19 19:06:40
lushuiw
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4樓2012-08-19 21:18:14
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