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[求助]
急求！��！胰蛋白酶水解魚精蛋白的方法�。。�
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| 本人做分子熒光探針，現(xiàn)為檢測(cè)魚精蛋白（protamine sulfate salt from salmom),需要水解魚精蛋白，魚精蛋白的主要成分（66%）為精氨酸，所以選擇用胰蛋白酶水解。實(shí)驗(yàn)條件為PH=8.5，T=25°，溶劑為PBS（20mM),并添加了鈣離子，可是總是不水解.....求助，怎樣配胰蛋白酶溶液？國產(chǎn)胰蛋白酶好嗎？為什么不水解呢？？？ |
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3樓2012-09-03 20:30:33
ottolzm
木蟲 (正式寫手)
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wizardfan: 金幣+5, 回答充滿了智慧，贊 2012-08-25 03:23:24
wizardfan: 金幣+5, 回答充滿了智慧，贊 2012-08-25 03:23:24
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幾個(gè)問題： 1.魚精蛋白66%為精氨酸，雖然精氨酸是可以被胰蛋白酶特異性識(shí)別和降解的，但是這個(gè)只是相對(duì)的，并且作用在其羧基端，你是不是可以再分析分析魚精蛋白的成分和特性； 2.動(dòng)物來源的胰蛋白酶需要鈣離子，也可以不需要，pH可以選擇pH8.0即可，溫度升高到37℃，將緩沖液換成20mMTris-HCL，并添加50mM Ca離子試試； 3.國產(chǎn)的胰酶品質(zhì)不均一，可以選擇進(jìn)一步純化過的，上海生工的胰蛋白酶粉末就不錯(cuò)，25g不到200RMB。 |
2樓2012-08-24 19:48:10
ottolzm
木蟲 (正式寫手)
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【答案】應(yīng)助回帖
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wizardfan: 金幣+10, 非常詳細(xì)的回答，值得鼓勵(lì)（5），另代樓主發(fā)金幣（5） 2012-09-04 04:19:21
wizardfan: 金幣+10, 非常詳細(xì)的回答，值得鼓勵(lì)（5），另代樓主發(fā)金幣（5） 2012-09-04 04:19:21
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呵呵 金幣不金幣的不要緊 關(guān)鍵在交流 正好做了點(diǎn)這方面的工作 給你說說 為什么鈣離子可加可不加 圇吞的講 鈣離子是胰蛋白酶的激活劑 對(duì)于不同來源的胰蛋白酶的激活作用有所差異 從機(jī)理上講 鈣離子的加入會(huì)致使胰蛋白酶分子內(nèi)部的鹽離子鍵作用更加強(qiáng)烈，胰蛋白酶的兩個(gè)β折疊形成的疏水孔結(jié)構(gòu)域更加穩(wěn)固 致使整體的Asp102,His57,Ser195,催化三聯(lián)體和Asp189,Gly216,Gly226所形成的底物結(jié)合口袋結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)固，二者相互協(xié)同的效率更加高效，從而使局部的酶催化效率提高，所以在相關(guān)的酶學(xué)性質(zhì)試驗(yàn)中，總能得到，添加鈣離子得到的酶活要稍高于不加鈣離子的酶活，但是從我了解到你的實(shí)驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩砜矗@點(diǎn)并不會(huì)對(duì)你的實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生影響，應(yīng)為添加鈣離子也不會(huì)造成多高的酶活的提高，而你的目的只是要求胰蛋白酶能降解你的蛋白質(zhì)，至于活力的定量的高低，并沒有多大作用，所以對(duì)此大可不必太多糾結(jié)，通過我用胰蛋白酶水解哺乳動(dòng)物細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)，這點(diǎn)可以得到很好地證明，加于不加鈣離子，并沒有本質(zhì)上的區(qū)別，可能只是在時(shí)間上的差別，加了鈣離子的催化的快一些，不加鈣離子的催化的相對(duì)慢一些，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這兩者是前者5分鐘完全水解好，后者可能需要延遲2-3分鐘；不知道這樣說是否能夠解答你的疑惑。 |
4樓2012-09-03 23:04:21
5樓2012-09-05 23:53:55
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