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[求助]
5'race 求助，萬分感激~~~
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| 各位大俠好，最近在做5‘race。用的是cloneth的SmartRace kit，引物Tm值在70度附近，操作的步驟完全按照kit的進(jìn)行：兩次PCR過程中，第一次用touchdowm PCR，后產(chǎn)物稀釋50倍，作nest PCR，68度退火，72延伸3min，25個(gè)cycles；看到有清晰的條帶，大小跟我想要的size差不多，回收做連接測序，結(jié)果是26S ribosomal RNA gene的部分序列，重新提取RNA并進(jìn)行檢測，cDNA也做了檢測，均沒有問題。然后做了race，結(jié)果得到size差不多的條帶，最后測序結(jié)果也是一樣。奇怪的是所得到的序列中也找不到我做pcr的引物，請問問題出在哪里了？我需要怎樣改進(jìn)我的實(shí)驗(yàn)條件？因?yàn)槭堑谝淮巫鰎ace，有很多都不懂，請大家指教。謝謝~ |
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2樓2012-08-30 19:34:34
yananhl
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3樓2012-09-18 10:35:03
4樓2012-09-18 16:27:45
yananhl
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5樓2012-09-18 16:45:50
6樓2012-09-19 14:05:22
wushuwei1104
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小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2012-09-19 15:13:29
小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2012-09-19 15:13:29
| 樓主最近做得怎么樣？我也在做5‘RACE，我跟你的情況大致一樣，用的試劑盒也是跟你一樣，但是我能在我的測序結(jié)果中找出做inner PCR的前、后引物，但是經(jīng)過序列比對，發(fā)現(xiàn)跟她的同源其他植物相比5’端缺少20左右bp，現(xiàn)在就不知道為什么會出現(xiàn)這種結(jié)果。是本身這種植物這個(gè)基因比同源其他植物基因短，還是在做5‘race時(shí)，RNA略有降解，但是前后引物都是存在的！ 糾結(jié)中------ |
7樓2012-09-19 14:44:26
8樓2012-09-19 16:23:41
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9樓2012-09-19 16:26:51
wushuwei1104
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10樓2012-09-19 19:40:21
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