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yesterday_07新蟲 (初入文壇)
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[求助]
限制性內(nèi)切酶，一直切不開……求助高手
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限制性內(nèi)切酶Nt.BbVCI，切雙鏈中CCTCAGC，但是遇到了切不開的問題。本來是想利用內(nèi)切酶信號(hào)放大來著，但做出來的信號(hào)甚至還不如不加內(nèi)切酶。 不知道我的操作還是哪兒出了問題： 120微升的反應(yīng)體系，兩個(gè)DNA雜交后24微升，內(nèi)切酶3微升,10×NEB緩沖液 12微升，雙蒸水稀釋至120微升，然后在37℃下溫育1-2h。（兩個(gè)DNA本身的緩沖液是PH7.9 TE溶液，10mM Tris—Hcl+1mMEDTA+0.3M NaCl，不知道這個(gè)緩沖液會(huì)否和NEB產(chǎn)生沖突？） NEB的內(nèi)切酶，據(jù)說不是那么容易失活（這個(gè)地方想問，網(wǎng)上說的‘冰上操作’是不是特別影響酶活性）； 還有，兩個(gè)DNA現(xiàn)在證明是可以雜交的（“能雜交”能證明純度足夠嗎？） 問題很多，求助高手解答。 （發(fā)現(xiàn)自己傾家蕩產(chǎn)也就1個(gè)金幣  大家別嫌棄）[ Last edited by yesterday_07 on 2012-8-30 at 18:08 ] |
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