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yesterday_07新蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
限制性?xún)?nèi)切酶，一直切不開(kāi)……求助高手
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限制性?xún)?nèi)切酶Nt.BbVCI，切雙鏈中CCTCAGC，但是遇到了切不開(kāi)的問(wèn)題。本來(lái)是想利用內(nèi)切酶信號(hào)放大來(lái)著，但做出來(lái)的信號(hào)甚至還不如不加內(nèi)切酶。 不知道我的操作還是哪兒出了問(wèn)題： 120微升的反應(yīng)體系，兩個(gè)DNA雜交后24微升，內(nèi)切酶3微升,10×NEB緩沖液 12微升，雙蒸水稀釋至120微升，然后在37℃下溫育1-2h。（兩個(gè)DNA本身的緩沖液是PH7.9 TE溶液，10mM Tris—Hcl+1mMEDTA+0.3M NaCl，不知道這個(gè)緩沖液會(huì)否和NEB產(chǎn)生沖突？） NEB的內(nèi)切酶，據(jù)說(shuō)不是那么容易失活（這個(gè)地方想問(wèn)，網(wǎng)上說(shuō)的‘冰上操作’是不是特別影響酶活性）； 還有，兩個(gè)DNA現(xiàn)在證明是可以雜交的（“能雜交”能證明純度足夠嗎？） 問(wèn)題很多，求助高手解答。 （發(fā)現(xiàn)自己傾家蕩產(chǎn)也就1個(gè)金幣  大家別嫌棄）[ Last edited by yesterday_07 on 2012-8-30 at 18:08 ] |
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無(wú)疆@行者
銀蟲(chóng) (小有名氣)
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【答案】應(yīng)助回帖
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zhang8826857: 金幣+1, 歡迎來(lái)微生物板塊交流 2012-09-08 17:04:53
zhang8826857: 金幣+1, 歡迎來(lái)微生物板塊交流 2012-09-08 17:04:53
| 小碩一枚，只是和樓主交流一下，首先DNA一般我用水溶解，TE應(yīng)該可以，不過(guò)離子可能會(huì)對(duì)酶活性產(chǎn)生影響，其次，公司說(shuō)明書(shū)中標(biāo)有酶的最適溫度，BUFFER，以及切割效率，可以看一下，增加下酶的用量。還有不知道LZ的模板是怎么來(lái)的，我有時(shí)候用qiangen柱子提取質(zhì)粒酶切效率就是不好，這時(shí)候會(huì)換一下柱子，或者換一個(gè)公司的酶 |
2樓2012-09-08 01:42:56
justavril
銀蟲(chóng) (初入文壇)
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3樓2021-11-10 17:59:56
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