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lovestrings金蟲 (小有名氣)
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[求助]
掃描電鏡樣品前處理
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小女子做的是弧菌的電鏡實(shí)驗(yàn)，曾經(jīng)做過一次，按照下面的步驟做的，但是效果不好，細(xì)菌拍下來不立體。 將菌液以3000r /min轉(zhuǎn)速離心10min后，棄上清液。注入 2.5%戊二醛，靜置2h以上固定。固定后離心，將細(xì)菌沉積，棄上清，以蒸餾水重懸浮，重復(fù)3次，最后以蒸餾水重懸。分別用30%、50 %、70 %、80%、90%梯度濃度酒精脫水，每個(gè)梯度中靜置 10min，脫水完畢，用純酒精脫水 3次，每次30min，然后用純叔丁醇置換酒精3次, 每次30min，最后吸取混勻的細(xì)菌-叔丁醇懸浮液滴在覆有蓋玻片的樣品臺(tái)上，置冷凍干燥機(jī)內(nèi)真空干燥。 有一些不明白的地方是：酒精梯度干燥的時(shí)候，靜置10分鐘后，是不是需要離心，然后棄上清，再加下一個(gè)梯度的酒精干燥？這個(gè)地方一直想不通，如果不離心的話，酒精中的水分不是一直都無法散去嗎？ |
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按以下步驟制備掃描電鏡樣品： 2.5%戊二醛固定 4 h→磷酸緩沖液洗滌 3 次→乙醇梯度脫水（分別為 30%、50%、70%、85%、90%乙醇各 1 次，100%乙醇 2 次，15 min/次）→ 乙酸異戊酯置換乙醇 2 次（20 min/次），每一步完成后經(jīng) 8000 r/min 離心 5 min。將樣品分別在 20℃、40℃和80℃冷凍 12 h，于冷凍干燥儀中干燥 12 h，備用。 我是這么做的。根據(jù)你的描述，有以下問題：①戊二醛固定時(shí)間不夠；②洗滌液不能用水，必須用磷酸緩沖液PBS（1/15 mol/L，pH=7.2；配方：Na2HPO4*12H2O取23.876g+KH2PO4取9.078g，分別溶于1 L水中，然后將二者按照7:3的體積比混合（V:V），就可以了。）；③不知道你的戊二醛是怎么配的？戊二醛應(yīng)該用以上的PBS來配置；④酒精梯度脫水，顧名思義就是要把水自由水除去，但是如果不按梯度，突然用100%來脫水是不行的，因?yàn)闈舛忍�，�?xì)胞形態(tài)就嚴(yán)重變形；按照我的這個(gè)梯度，我做出來非常漂亮；⑤ 在冷凍干燥前，必須把脫去自由水的樣品按照從-20→-40→-80的梯度冷凍，目的把結(jié)合水固定住，梯度原理與④相同；⑥ 乙酸異戊酯的目的是置換掉乙醇，該藥品神經(jīng)毒，請?jiān)谕L(fēng)櫥進(jìn)行，不過只是有機(jī)物而已，偶爾接觸沒關(guān)系，不用怕。凡藥品都有毒的。無法附圖片，不然給你看看我拍的。希望對你有幫助。 |
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