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[求助]
植物ROS
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| 我測(cè)魚(yú)和蚯蚓ROS時(shí)要取線粒體懸浮液前處理是這樣的：魚(yú)是取肝臟研磨成液，1000g離20min，取上清，20000g也是離20min，蚯蚓是直接研磨成液，然后剩余步驟同魚(yú)�，F(xiàn)在我要做小麥的，我查過(guò)植物線粒體的提取方法，太麻煩，而且取完線粒體會(huì)對(duì)后面的實(shí)驗(yàn)有影響，所以想有沒(méi)有必要那么麻煩呢，我想再采取魚(yú)和蚯蚓那樣的前處理方法來(lái)做植物的可行性有多少？大家來(lái)說(shuō)說(shuō)看。 |
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2樓2012-09-05 19:35:09
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但是文獻(xiàn)所用的取線粒體的緩沖液中含牛血清蛋白，這樣我按文獻(xiàn)的方法取到線粒體再重懸浮后去測(cè)蛋白會(huì)對(duì)我的蛋白含量有影響啊（因?yàn)槲蚁乱徊綔y(cè)ROS時(shí)要先測(cè)下蛋白含量來(lái)確定酶液量和探針的量） 我查的文獻(xiàn)取線粒體的緩沖液及步驟是這樣的，你幫我看看他哪一步或者哪一個(gè)試劑是用來(lái)破除細(xì)胞壁的？（假如他也沒(méi)有破除細(xì)胞壁的步驟那我用動(dòng)物的方法也不可以嗎？簡(jiǎn)單的研磨再差速離心取不到植物的線粒體？）你幫我看看哈，謝謝你我不懂啊。。。 勻漿緩沖液:50mmol/LTris-HCl， 25mmol/LEDTA，pH8.0， 1.3mo/LNaCl，0.2%BSA，使用前再加L-半胱氨酸和β-巰基乙醇。 稱(chēng)取小麥幼苗葉片, 加入5倍體積預(yù)冷的勻漿緩沖液, 用預(yù)冷的研缽充分破碎組織, 經(jīng)6 層紗布過(guò)濾, 濾渣加入3 倍體積的勻漿緩沖液 繼續(xù)破碎,兩次濾液合并后分裝于15mL 離心管。將濾液用高速冷凍離心機(jī)1000 g離心10min; 取上清液2000 g 離心15 min, 并重復(fù)此步操作。將得到的上清液18000 g 離心15 min, 棄上清,得到粗線粒體沉淀。向每管沉淀中加入5mL 預(yù)冷的勻漿緩沖液, 并將沉淀重懸浮, 18000 g 離心15min, 充分棄掉上清液, 得到較純的線粒體沉淀。 |
3樓2012-09-06 10:04:18
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【答案】應(yīng)助回帖
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慚愧，昨天回答你問(wèn)題的時(shí)候沒(méi)有多想想。 首先，關(guān)于細(xì)胞壁，我采取的方案是用石英砂研磨，但這個(gè)和動(dòng)物細(xì)胞直接研磨估計(jì)差別不大，所以細(xì)胞壁不是太大的影響因素。而質(zhì)體存在，由于都是用差速離心，估計(jì)也不是大影響因素。你的問(wèn)題實(shí)際上集中在能否換用動(dòng)物細(xì)胞的緩沖液，是么？我依然覺(jué)得不可以，尤其是BSA，我認(rèn)為它的作用是作為競(jìng)爭(zhēng)性底物削弱蛋白酶的作用，這樣可以保證分離的線粒體完整。同時(shí)，BSA的存在還可以抑制脂肪酸及其他脂類(lèi)物質(zhì)對(duì)線粒體的毒害。所以如果要研究線粒體功能，必須如此。 至于測(cè)定線粒體ROS產(chǎn)生，我看過(guò)的文章不多，基本上都是用H2DCFDA，不知道你計(jì)劃怎么做？ 另外，你的方法中用到1.3 mol/l氯化鈉，我看到的方法多為甘露醇/蔗糖+BSA+EDTA+Tris-Hcl，為了維持等滲，氯化鈉需要這么高的濃度么？你的方法出自什么文獻(xiàn)？ |
4樓2012-09-06 19:09:54
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我參照的是一篇碩士論文，他也有文獻(xiàn)發(fā)出，題目是：小麥線粒體DNA 的高效提取方法 作者是：李文強(qiáng) 我測(cè)ROS用的也是DCFH-DA法，我就是研磨完樣品，重懸浮，然后去測(cè)蛋白含量，根據(jù)已經(jīng)測(cè)好的蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出所需酶液，然后再根據(jù)方法里酶液和探針的關(guān)系算出需要加的探針含量，然后水浴加熱，再去用熒光分光光度計(jì)測(cè)。 其實(shí)我也不是想測(cè)定線粒體里的ROS，我就是想測(cè)整個(gè)的ROS，但是師哥師姐們測(cè)蚯蚓ROS時(shí)就是這樣差速離心說(shuō)是取線粒體，我就照著他們說(shuō)的變動(dòng)了下找到植物取線粒體的方法，再和我們已有的DCFH-DA法相結(jié)合來(lái)測(cè)ROS。 師哥師姐們測(cè)魚(yú)和蚯蚓的ROS時(shí)的緩沖液就是簡(jiǎn)單的磷酸緩沖液，并沒(méi)有加什么BSA來(lái)保證線粒體完整，而且最后也測(cè)出來(lái)了，而且剛發(fā)了篇SCI，我感覺(jué)我們這種測(cè)ROS就是大體測(cè)一下吧，看看總體有什么趨勢(shì)，并不需要測(cè)的很精確。 我也問(wèn)過(guò)師哥師姐說(shuō)你們這么簡(jiǎn)單的差速離心下就能取到線粒體嗎？他們也說(shuō)不上來(lái)，反正他們測(cè)ROS就是這么簡(jiǎn)單的進(jìn)行下前處理就可以測(cè)，現(xiàn)在我做植物想按他們的來(lái)，粗略的測(cè)下ROS的情況，要是按文獻(xiàn)那種方法來(lái)取線粒體太麻煩而且那個(gè)緩沖液由于加了BSA對(duì)我的結(jié)果有影響 |
5樓2012-09-06 19:26:09
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6樓2012-09-06 19:38:08
7樓2012-09-06 20:04:07
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【答案】應(yīng)助回帖
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至于提取方法，我總覺(jué)得你提供那篇文獻(xiàn)的方法氯化鈉濃度偏高，應(yīng)當(dāng)是適于獲得完整線粒體DNA的，而非完整線粒體。建議你參考更經(jīng)典的文獻(xiàn)，例如： E Petrussa, A Bertolini, J Krajnakova. Isolation of mitochondria from embryogenic cultures of Picea abies (L.) Karst. and Abies cephalonica Loud.: characterization of a channel. Plant cell Rep. 2008, 27: 137-146. Christine A. Robson and Greg C. Vanlerberghe Transgenic Plant Cells Lacking Mitochondrial Alternative Oxidase Have Increased Susceptibility to Mitochondria-Dependent and -Independent Pathways of Programmed Cell Death Plant Physiology, August 2002, Vol. 129, pp. 1908–1920 |
8樓2012-09-06 20:28:43
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a71840584: 金幣+5, ★★★很有幫助 2012-09-06 20:45:29
a71840584: 金幣+5, ★★★很有幫助 2012-09-06 20:45:29
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用熒光顯微鏡做并不復(fù)雜，隨便照片好點(diǎn)的文章照著做就行。不明白你所問(wèn)的前處理是什么？我所說(shuō)的方法，簡(jiǎn)單來(lái)講，對(duì)樣品加試劑處理，加載探針（就是把材料置于探針溶液中），觀察，拍照就可以了。具體我隨便找了篇文章，你可以參考一下 Two Distinct Sources of Elicited Reactive Oxygen Species in Tobacco Epidermal Cells Andrew C. Allan and Robert Fluhr The Plant Cell, Vol. 9, 1559-1572 你用含BSA的緩沖液離心，樣品中就會(huì)多少有外來(lái)蛋白，如果沒(méi)有，BSA怎么發(fā)揮保護(hù)作用？如果你對(duì)結(jié)果要求不是特別嚴(yán)格，就找你說(shuō)的做吧，但我很懷疑這樣的結(jié)果怎么合理的寫(xiě)在文章中。 |
» 本帖已獲得的紅花（最新10朵）
a718405849樓2012-09-06 20:37:54
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10樓2012-09-06 20:43:13
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