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養(yǎng)活它新蟲 (初入文壇)
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[求助]
有誰做過細(xì)菌的PCR實驗嗎？
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有誰做過細(xì)菌的PCR實驗嗎？想向各位高手求救一下幾個問題： 現(xiàn)在我做微生物培養(yǎng)（大腸），需要進(jìn)一步做PCR，我的方法如下： 開始從冰箱拿到菌源，先進(jìn)行普通平板活化，然后再挑取疑似菌落進(jìn)行平板劃線，進(jìn)一步篩選（伊紅美蘭篩選培養(yǎng)基），然后再進(jìn)一步做個生化鑒定試驗，確定該菌為目的菌。確定目的菌之后，再進(jìn)行LB培養(yǎng)，測定其OD 600,然后取菌液進(jìn)行稀釋（十個梯度），接著進(jìn)行倒平板培養(yǎng)、計數(shù)（按照國標(biāo)）。 1 針對我的方案，麻煩各位專家提點不足之處。 2 我的方案里面涉及的培養(yǎng)基，有沒有不合適的？ 3 方案里的生化試驗，從經(jīng)濟(jì)、快速、準(zhǔn)確來考慮，最好選哪個？ 希望大家多多提出寶貴意見和建議。謝謝！ |
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
zhang8826857: 金幣+5, good，很熱心的蟲子 2012-09-10 17:56:41
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zhang8826857: 金幣+5, good，很熱心的蟲子 2012-09-10 17:56:41
| 實驗步驟還可以，第一步活化，然后挑取疑似菌落劃線，我覺得不太好，后一步已經(jīng)有選擇培養(yǎng)基了，這一步可以在液體中活化6個小時后，然后篩選，鑒定階段，可以提質(zhì)粒然后酶切，或者PCR鑒定，或者直接菌液PCR，我用的方法是，挑取菌落，液體培養(yǎng)6個小時，然后按照PCR一般體系擴(kuò)增，最后送去測序，一切以測序結(jié)果為準(zhǔn)。省時的話還是直接菌液PCR，然后測序比較好。 |
2樓2012-09-10 14:19:34
3樓2012-09-10 16:52:50
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4樓2012-09-10 20:44:51
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5樓2012-09-10 21:01:25
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【答案】應(yīng)助回帖
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scelab: 金幣+5, x謝謝熱心交流~ :) 2012-09-13 10:35:47
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沒說明為什么用伊紅美蘭培養(yǎng)基，如果細(xì)菌有質(zhì)粒，直接用質(zhì)粒上帶的抗生素抗性基因篩選（注意活化時間）或者藍(lán)白斑篩選，跳取疑似單菌落，小規(guī)模試管（抗生素）搖菌提取質(zhì)粒電泳鑒定。也可以在平板上大規(guī)模挑取單菌落做菌落PCR。 還有不明白你進(jìn)行菌落計數(shù)是什么意思，如果測定細(xì)菌生長曲線之類的直接測定OD600或者菌體濕重就可以了 |
8樓2012-09-13 10:25:55
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