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DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Germany)試劑盒中文操作說明書
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一．利用DNeasy® Blood & Tissue試劑盒提取樣本總DNA 1．前處理： 注意： 1） 石蠟包埋組織的DNA一般小于650bp，還要視樣本類型與保存年限而定。 2） 固定劑一般為福爾馬林或酒精。不推薦用蛾酸固定的樣本。 3） 溶解時(shí)間隨樣本類型和溶解狀態(tài)而定。 4） 產(chǎn)量視樣本類型和保存年限而定。推薦用50-100ul的AE緩沖液洗脫純化的DNA。 5） 開始前要預(yù)熱孵化器或水浴鍋至37℃，用于操作步驟9）。 1.石蠟包埋組織的前處理 操作步驟： 1） 將小片石蠟包埋的組織（小于25mg）放入2ml離心管中（自備）。 2） 加入1200ul的二甲苯，用力渦旋震蕩。 3） 最大轉(zhuǎn)速室溫（15-25°）離心5分鐘。 4） 移液槍吸去上清。小心不要吸去沉淀。 5） 往沉淀中加1200ul的（96-100%）酒精（目的是洗去剩余二甲苯），輕柔地震蕩。 6） 最大轉(zhuǎn)速室溫（15-25°）離心5分鐘。 7） 移液槍吸去上清。小心不要吸去沉淀。 8） 重復(fù)一次步驟5-7。 9） 37°孵育10-15分鐘，孵育過程打開離心管蓋，直到酒精蒸發(fā)干凈。 10） 加入180ul的ATL緩沖液，繼續(xù)提取組織總DNA中的步驟2。 2．福爾馬林組織的前處理 操作步驟： 1） 用PBS潤洗組織樣本（小于25mg）兩次（目的是去除固定劑）。 2） 去PBS，繼續(xù)提取組織總DNA中的步驟1. 2．動物組織總DNA的提取 注意： 1） ATL緩沖液和AL緩沖液可能存儲后沉淀，如果沉淀，在56°孵育直至沉淀溶解。 2） 在AW1緩沖液和AW2緩沖液中加入一定量（見瓶身）的（96%-100%）酒精，然后才使用。 3） 打開水浴鍋至56℃，用于步驟2。 4） 如果是凍存的樣本，拿出來室溫預(yù)熱，避免反復(fù)凍融。 操作步驟： 1） 取25mg組織，切成小塊，放入1.5ml的離心管中。加入180ul的Buffer ATL。 2） 加入20ul的蛋白酶K。渦旋震蕩（5-10S）。56℃孵育直至組織消化完全，一般為1-3小時(shí)。偶爾間斷的拿出震蕩。 3） 渦旋震蕩15S，加入200ul的Buffer AL,渦旋充分混勻。加入200ul的（96%-100%）的酒精。渦旋充分混勻。（注：樣多時(shí)可將AL和酒精預(yù)混以節(jié)省時(shí)間） 4） 轉(zhuǎn)移步驟3中的所有混合液至DNeasy Mini spin離心柱，柱子放在2ml的收集管上（已提供），≧6000g（8000rpm）離心1分鐘。棄收集管/液。 5） 將離心柱放在一個新的2ml收集管上（已提供）加500ul緩沖液AW1，≧6000g（8000rpm）離心1分鐘。棄收集管/液。 6） 將離心柱放在一個新的2ml收集管上（已提供）。加500ul緩沖液AW2，20000g（14000rpm）離心3分鐘。棄收集管/液。 7） 將離心柱放在一個新的1.5或2ml離心管（自備）上，吸200ul的緩沖液AE在吸附膜上，室溫1分鐘，≧6000g（8000rpm）離心1分鐘。 8） 為增大DNA產(chǎn)量，重復(fù)步驟7（注意：從離心管中吸取液體反復(fù)洗脫）。 3．動物血液或細(xì)胞中提取DNA 1） 取50-100ul的抗凝血至1.5ml或2ml離心管中（自備），加20ul蛋白酶K，用PBS補(bǔ)加至220ul。 2) 加入200ul緩沖液AL，渦旋震蕩充分混勻，56℃孵育10min。 3）加入200ul的（96%-100%）酒精，渦旋震蕩充分混勻。 4）移取步驟3的混合液至離心柱上，離心柱放在2ml收集管上（已提供）。≧6000g（8000rpm）離心1分鐘。棄收集管/液。 5）離心柱放至新的2ml收集管上（已提供），加500ul的緩沖液AW1，≧6000g（8000rpm）離心1分鐘。棄收集管/液。 6）離心柱放至新的2ml收集管上（已提供），加500ul的緩沖液AW2，20000g（14000rpm）離心3分鐘。棄收集管/液。 7）將離心柱放在一個新的1.5或2ml收集管（自備）上，吸200ul的緩沖液AE在吸附膜上，室溫1分鐘，≧6000g（8000rpm）離心1分鐘。 8）為增大DNA產(chǎn)量，重復(fù)步驟7（注意：從離心管中吸取液體反復(fù)洗脫）。 |
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