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wuxiaoyan06

金蟲 (小有名氣)

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[求助] 請(qǐng)問如何設(shè)計(jì)兼并引物

本人最近在學(xué)習(xí)怎么設(shè)計(jì)兼并引物，通過比對(duì)20種該基因的氨基酸序列找到了它的保守區(qū)域，用primer5設(shè)計(jì)引物簡(jiǎn)并度太高不知道怎么取舍，不知道用什么軟件設(shè)計(jì)兼并引物好，各位可不可以給些見意和方法啊，謝謝了！

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1樓 2012-09-11 17:15:05

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水牛默默

金蟲 (正式寫手)

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【答案】應(yīng)助回帖

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wuxiaoyan06: 金幣+5, 博學(xué)EPI+1, ★★★很有幫助 2012-10-06 17:13:56

理論上說：由氨基酸回導(dǎo)核酸序列，同時(shí)考慮到細(xì)菌使用密碼子的偏愛性，以減少兼并度，但是這樣得到的兼并引物的兼并密碼子比較多，我建議你可以先從網(wǎng)上找到已經(jīng)報(bào)道的比較近的幾種菌的序列，然后比對(duì)，設(shè)計(jì)兼并引物，這樣做沒問題，我覺得還比較簡(jiǎn)便，因?yàn)槲揖褪沁@么做的，也沒用primer軟件��！
另外3端最好不是兼并密碼子，你可以在網(wǎng)上查查看。

下面是網(wǎng)上找到的詳細(xì)的簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)原則和Primer5.0 設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物的方法可以參考下：
簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)原則：
1．  選擇高度保守的序列作為引物。如果可能的話，選擇在基因家族內(nèi)和不同種屬間都保守的序列。
2．  選擇兼并度最小的序列
a.  含有色氨酸和甲硫氨酸的肽段為首選，因?yàn)槠涿艽a子是唯一的
b.  盡可能不用含有亮氨酸、精氨酸、絲氨酸的肽段。
3．  若引物序列高度簡(jiǎn)并，利用脊椎動(dòng)物基因組中CpG二核苷酸的較低豐度，可望降低兼并度。并結(jié)合密碼子優(yōu)先表，或在有兼并度的地方引入次黃苷來降低兼并度。
4．  引物的3‘端殘基盡可能使用確定殘基。但令人吃驚的是，當(dāng)G、C或T發(fā)生錯(cuò)配時(shí)，3’端的T殘基相對(duì)保持中立。
5．  PCR產(chǎn)物的合適長度為200～1000bp。
6．  如果蛋白中有兩個(gè)以上的區(qū)域高度保守，可構(gòu)建幾套PCR引物，以便使用“巢式”PCR來增加特異性。
PCR反應(yīng)條件
1．  退火溫度總的來說，退火溫度越低，非特異性擴(kuò)增的可能性越大。低至37度的退火溫度也可被采用于高度簡(jiǎn)并的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。Touchdown PCR也可以減少錯(cuò)誤擴(kuò)增
2．  擴(kuò)增的循環(huán)數(shù) 過多循環(huán)數(shù)導(dǎo)致非特異性帶的產(chǎn)生；可以每5個(gè)循環(huán)取一定樣品來檢測(cè)擴(kuò)增的特異性
3．  降溫時(shí)間不同的PCR儀效率不同。較長的降溫時(shí)間有利于錯(cuò)配雜交的產(chǎn)生
4．  PCR緩沖液成分主要在于Mg＋＋離子的濃度。

Primer5.0 設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物的方法：
首先把各個(gè)CDs序列分別存儲(chǔ)為fasta格式，然后在 file-open-DNA sequence 里邊把各個(gè)序列依次加入，然后點(diǎn)擊align，比對(duì)完之后再點(diǎn)擊primer，調(diào)整參數(shù)進(jìn)行search或手工拉動(dòng)選擇引物。表現(xiàn)的形式是非簡(jiǎn)并性的，但是你從下邊可以看得出來哪個(gè)堿基是非簡(jiǎn)并性的，再手工調(diào)整。其他原則同一般的簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)原則，如3‘避免簡(jiǎn)并性等等。
還可以在線用codehop設(shè)計(jì)，如果需要這種方法，我可以告訴你怎么搞。

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2樓2012-10-02 21:13:30