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wanghd2826

鐵蟲 (小有名氣)

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[求助] 自設(shè)簡(jiǎn)并引物幾對(duì)，請(qǐng)高手幫檢查下~~~

剛開始學(xué)習(xí)簡(jiǎn)并引物的設(shè)計(jì)，看了幾篇經(jīng)典的帖子，受益匪淺，按照步驟嘗試設(shè)計(jì)了幾對(duì)，但是對(duì)于簡(jiǎn)并引物的檢測(cè)還不是很有信心，比如退火溫度、錯(cuò)配率等等如何協(xié)調(diào)到最優(yōu)，希望各路蟲友幫忙看下這幾對(duì)合適不。
上5’-GCYGGITTYGARACITCITCNAC-3’    下5’-CCRAAICGCATNCCDATRCA-3’

上5’-GARACICTICGNAARTAYCCNC-3’    下5’-CCRAAICGIAGNCCDATRCA-3’

上5’-GCYGGITTYGARACITCITCNAC-3’    下5’-CGIGGNCCYTCNCCIAAIGG-3’

上5’-GARACICTICGNAARTAYCCNC-3’    下5’-CCRAAICGCATNCCDATRCA-3’

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1樓 2011-08-08 22:54:15

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love_st

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★ ★
dhd997(金幣+2): 鼓勵(lì) 2011-08-10 12:13:17

為什么簡(jiǎn)并點(diǎn)都設(shè)計(jì)在3‘末端，主要從3’末端開始延伸，這樣容易錯(cuò)配，還有為什么都是A結(jié)尾啊，容易錯(cuò)配，簡(jiǎn)并數(shù)未免有點(diǎn)多

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2樓2011-08-09 10:02:13

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第五平原

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【答案】應(yīng)助回帖

★ ★
dhd997(金幣+2): 歡迎討論 2011-08-10 12:13:31

2樓說的對(duì)，3’的堿基以A結(jié)尾很容易引發(fā)錯(cuò)配，最好是能以T結(jié)尾，另外上下游引物之間CG含量和退火溫度差異不要太大。

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勤勉

3樓2011-08-09 12:33:51

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wanghd2826

鐵蟲 (小有名氣)

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2樓: Originally posted by love_st at 2011-08-09 10:02:13:
為什么簡(jiǎn)并點(diǎn)都設(shè)計(jì)在3‘末端，主要從3’末端開始延伸，這樣容易錯(cuò)配，還有為什么都是A結(jié)尾啊，容易錯(cuò)配，簡(jiǎn)并數(shù)未免有點(diǎn)多

多謝幫忙啊~
不過我看到許多文獻(xiàn)中的3‘端也是簡(jiǎn)并的啊，這里確實(shí)有點(diǎn)不理解。我該怎么修改呢？

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4樓2011-08-10 09:53:09

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3樓: Originally posted by 第五平原 at 2011-08-09 12:33:51:
2樓說的對(duì)，3’的堿基以A結(jié)尾很容易引發(fā)錯(cuò)配，最好是能以T結(jié)尾，另外上下游引物之間CG含量和退火溫度差異不要太大。

請(qǐng)問是不是簡(jiǎn)并引物的退火溫度越高越好呢，例如在70度左右，還有就是我用PP5和Oligo6檢測(cè)得到的退火溫度不一樣啊差別還不小，應(yīng)該用哪個(gè)軟較好呢？

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5樓2011-08-10 09:55:06

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jinkui960

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引用回帖:

4樓: Originally posted by wanghd2826 at 2011-08-10 09:53:09:
多謝幫忙啊~
不過我看到許多文獻(xiàn)中的3‘端也是簡(jiǎn)并的啊，這里確實(shí)有點(diǎn)不理解。我該怎么修改呢？

只要3端的最后一個(gè)堿基不是兼并性的就可以了，沒有關(guān)系的，我們得簡(jiǎn)并引物都是這樣設(shè)計(jì)的！

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6樓2011-08-10 10:01:03

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★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金幣+3): good 2011-08-10 12:13:44
西瓜(金幣+5): 學(xué)習(xí)了！很有經(jīng)驗(yàn)?zāi)兀?2011-08-10 17:56:19
wanghd2826(金幣+15): 多謝指點(diǎn)，以后有不懂的地方再請(qǐng)教前輩！ 2011-08-11 23:16:14
西瓜: 漏了EPI，現(xiàn)在補(bǔ)上，抱歉哦！ 2011-08-12 00:15:54
西瓜(MolEPI+1): 2011-08-12 09:06:50

引用回帖:

5樓: Originally posted by wanghd2826 at 2011-08-10 09:55:06:
請(qǐng)問是不是簡(jiǎn)并引物的退火溫度越高越好呢，例如在70度左右，還有就是我用PP5和Oligo6檢測(cè)得到的退火溫度不一樣啊差別還不小，應(yīng)該用哪個(gè)軟較好呢？

既然是簡(jiǎn)并引物，目的引物的序列是不確定的，你用軟件檢測(cè)是沒有辦法計(jì)算得到簡(jiǎn)并引物的TM值的，推薦使用Touch-down PCR程序，引物之間的TM差別大一點(diǎn)沒有關(guān)系的，我們以前曾經(jīng)計(jì)算過，利用簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增得到目的序列，測(cè)序以后發(fā)現(xiàn)兩條引物之間的TM值差別達(dá)到15-20度，所以不要太糾結(jié)于簡(jiǎn)并引物的TM，只要注意引物的GC值不要太高和太低就可以了。
祝順利！

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7樓2011-08-10 10:08:12

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★
西瓜(金幣+1): 鼓勵(lì)應(yīng)助 2011-08-10 17:56:31

引用回帖:

往前挪動(dòng)，避免在3‘端就好了，文獻(xiàn)豈可全信

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8樓2011-08-10 10:46:33

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8樓: Originally posted by love_st at 2011-08-10 10:46:33:
往前挪動(dòng)，避免在3‘端就好了，文獻(xiàn)豈可全信

對(duì)，文獻(xiàn)里的引物有的是不靠譜啊，簡(jiǎn)并度高的可怕，但是老板非要說必須要用文獻(xiàn)里的，另外自己再設(shè)計(jì)幾對(duì)，郁悶。

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9樓2011-08-11 23:18:16

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7樓: Originally posted by jinkui960 at 2011-08-10 10:08:12:
既然是簡(jiǎn)并引物，目的引物的序列是不確定的，你用軟件檢測(cè)是沒有辦法計(jì)算得到簡(jiǎn)并引物的TM值的，推薦使用Touch-down PCR程序，引物之間的TM差別大一點(diǎn)沒有關(guān)系的，我們以前曾經(jīng)計(jì)算過，利用簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增得到目的 ...

多謝提供寶貴建議！我還想問下，簡(jiǎn)并引物一般簡(jiǎn)并度在多少以內(nèi)比較合適呢，我看到有的文獻(xiàn)（英文）簡(jiǎn)并引物簡(jiǎn)并度高的可怕。。另外，看到有帖子發(fā)到用CODEHOP方法設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，自己也嘗試了幾對(duì)，用的是在線CODEHOP設(shè)計(jì)的，不知道這種方法設(shè)計(jì)出的引物效果如何呢？

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10樓2011-08-11 23:23:36

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