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關(guān)于Transwell遷移實(shí)驗(yàn)的一些問(wèn)題
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最近在做Transwell遷移實(shí)驗(yàn)，但一直不是很成功，下面有幾個(gè)問(wèn)題想跟大家探討一下，還請(qǐng)各位蟲(chóng)友不吝賜教。 1、上層小室加的細(xì)胞懸液為什么要含0.5%的BSA，BSA的作用是什么。 2、下層我用的是含5%FBS的培養(yǎng)基，曾經(jīng)用過(guò)0.4%FBS的培養(yǎng)基，細(xì)胞沒(méi)遷移過(guò)去，下層小室FBS是不是含量越低越好。 3、還有就是transwell小室實(shí)驗(yàn)前需不需要怎么處理一下，比如用無(wú)血清培養(yǎng)基浸潤(rùn)半個(gè)小時(shí)什么的。 4、加完細(xì)胞懸液后一般多長(zhǎng)時(shí)間染色觀察，我看文獻(xiàn)有說(shuō)5h，但是我覺(jué)得5h根本都遷移不過(guò)去。 |
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凝冰897
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boylover123(金幣+1): 謝謝參與
wizardfan: 金幣+3, 應(yīng)助指數(shù)+1, 很詳細(xì)的回答 2012-09-30 08:04:58
boylover123: 金幣+4, 謝謝你的回答，很詳細(xì)，很受用 2013-01-11 20:39:25
boylover123(金幣+1): 謝謝參與
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boylover123: 金幣+4, 謝謝你的回答，很詳細(xì)，很受用 2013-01-11 20:39:25
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遷移和侵襲我都做過(guò)，我來(lái)答吧： 1、上層小室加的細(xì)胞懸液為什么要含0.5%的BSA，BSA的作用是什么。 答：是為了保持滲透壓，不至于讓上室的水分滲透到下室太多，影響了藥物濃度（如果加藥的話）和實(shí)驗(yàn)結(jié)果。也可以用1%的FBS。 2、下層我用的是含5%FBS的培養(yǎng)基，曾經(jīng)用過(guò)0.4%FBS的培養(yǎng)基，細(xì)胞沒(méi)遷移過(guò)去，下層小室FBS是不是含量越低越好。 不是，上室FBS含量要低于下室，F(xiàn)BS里除含有養(yǎng)分外，也含有趨化因子，F(xiàn)BS濃度差是細(xì)胞遷移的誘導(dǎo)動(dòng)力。如無(wú)特殊要求，下室濃度可用細(xì)胞培養(yǎng)液中FBS的濃度，即10%。 3、還有就是transwell小室實(shí)驗(yàn)前需不需要怎么處理一下，比如用無(wú)血清培養(yǎng)基浸潤(rùn)半個(gè)小時(shí)什么的。 如果是遷移的話不用；如果是侵襲實(shí)驗(yàn)的話，因?yàn)閠ranswell小室上鋪有Matrigel，所以要無(wú)血清培養(yǎng)基侵潤(rùn)一到兩個(gè)小時(shí)，叫做“水化基底膜” 4、加完細(xì)胞懸液后一般多長(zhǎng)時(shí)間染色觀察，我看文獻(xiàn)有說(shuō)5h，但是我覺(jué)得5h根本都遷移不過(guò)去。 這個(gè)要看細(xì)胞的遷移能力了。如果用的是正常細(xì)胞，如表皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等，其遷移能力較弱，需要24小時(shí)甚至更長(zhǎng)的時(shí)間；如果是腫瘤細(xì)胞，則較快；如果是高度惡性腫瘤細(xì)胞（就是高轉(zhuǎn)移腫瘤，比如人的卵巢癌、膀胱癌等），遷移能力很強(qiáng)，5、6個(gè)小時(shí)就能遷移過(guò)去。并且，這個(gè)跟所種的細(xì)胞數(shù)也相關(guān)，需要摸一下條件。宗旨就是：在遷移時(shí)間內(nèi)，陰性對(duì)照組（不加藥的情況下）只有部分細(xì)胞遷移到下室，而不是全部。我的意思是，如果時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，全部細(xì)胞慢慢挪，是可以都挪到下室的，這樣可能導(dǎo)致陰性組和加藥組看不出應(yīng)有的差別來(lái)。當(dāng)然過(guò)短也不行，只有極少的細(xì)胞遷移了，結(jié)果還是不明顯，所以需要摸一下條件。 另外囑咐幾點(diǎn)： 一是，實(shí)驗(yàn)結(jié)束染色后，別忘了單獨(dú)觀察一下下室中是否有掉落的細(xì)胞，有時(shí)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞數(shù)較多或?qū)嶒?yàn)時(shí)間較長(zhǎng)（比如超過(guò)24小時(shí)），細(xì)胞在小室的底部粘不牢，掉到下室去，未能被染色，影響統(tǒng)計(jì)結(jié)果。若有，則下次實(shí)驗(yàn)可在上室底部包被FN（纖維粘連蛋白），增強(qiáng)粘附。尤其是用正常細(xì)胞的時(shí)候。 二是，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，盡快染色，勿讓細(xì)胞風(fēng)干，否則細(xì)胞會(huì)有破裂的現(xiàn)象，染完色后在顯微鏡下不好看，爛乎乎的。在這里提示一個(gè)小tip：如果用結(jié)晶紫染色，感覺(jué)細(xì)胞很多怕計(jì)數(shù)不準(zhǔn)的話，可以用醋酸將結(jié)晶紫洗下，上酶標(biāo)儀讀OD（我一時(shí)忘了波長(zhǎng)了，這個(gè)可以查一下），用以輔助驗(yàn)證結(jié)果。這里醋酸洗掉的只是結(jié)晶紫，細(xì)胞還在，還可以再次用結(jié)晶紫復(fù)染，顯微鏡下看，效果與初染幾無(wú)差別 |
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14樓2012-09-29 23:36:07
凝冰897
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好久了啊，呵呵 我記得應(yīng)該是這樣的：首先遷移的細(xì)胞要大致均勻，否則怎么都不好選（如果是侵襲實(shí)驗(yàn)，那么嚴(yán)重不均勻的實(shí)驗(yàn)結(jié)果本身也不可信，因?yàn)橄喈?dāng)于某處穿了一個(gè)“洞”，然后剩下的細(xì)胞就不必降解基底膜了，直接麻溜地聚集到那里鉆過(guò)去就行了）；大致均勻的前提下，選取某條直徑上的五個(gè)視野拍照，然后計(jì)數(shù)，取平均值，這是一次；再選取另一條直徑，結(jié)果作為第二次；第三次相同。三次的計(jì)數(shù)除以陰性對(duì)照組的計(jì)數(shù)（方法相同），得到的百分率即為遷移率。然后三次計(jì)算得到的遷移率取平均值，算標(biāo)準(zhǔn)差，得到最后結(jié)果 這是最嚴(yán)謹(jǐn)?shù)囊环N~~ |
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26樓2015-09-07 18:53:57
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遷移就是要觀察癌細(xì)胞或具有遷移能力的細(xì)胞從營(yíng)養(yǎng)貧瘠處往豐富處遷移的能力。 1、第一個(gè)問(wèn)題：加BSA的作用就是要模擬小室下層加的FBS的環(huán)境，保證實(shí)驗(yàn)的嚴(yán)謹(jǐn)性。 2、第二個(gè)問(wèn)題：FBS用平常正常的比例就行，平常應(yīng)該都是10%的FBS。0.4明顯太小了，跟沒(méi)加一樣，細(xì)胞當(dāng)然不容易遷移過(guò)去。 3、在細(xì)胞懸液加到小室前，需要事先浸潤(rùn)。我之前就是直接浸潤(rùn)在有加FBS的培養(yǎng)基。不過(guò)我認(rèn)為你說(shuō)的應(yīng)該更嚴(yán)謹(jǐn)些。 4、不同細(xì)胞的遷移能力不同。所以需要事先做個(gè)時(shí)間梯度，把握下大概的時(shí)間。通常我控制在10個(gè)小時(shí)左右。 |
13樓2012-09-29 23:11:05
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小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
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| 樓主，你能將你的遷移實(shí)驗(yàn)步驟的文獻(xiàn)發(fā)給我么？我也想學(xué)習(xí)一下lizhiwei10291@126.com ,謝了。 |
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小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
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xiejf5樓
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江南的竹8樓
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104688987711樓
2012-09-29 21:13
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2012-09-29 21:41
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wizardfan15樓
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janezqf21樓
2013-03-20 16:52
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