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[交流]
關于Transwell遷移實驗的一些問題
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最近在做Transwell遷移實驗，但一直不是很成功，下面有幾個問題想跟大家探討一下，還請各位蟲友不吝賜教。 1、上層小室加的細胞懸液為什么要含0.5%的BSA，BSA的作用是什么。 2、下層我用的是含5%FBS的培養(yǎng)基，曾經(jīng)用過0.4%FBS的培養(yǎng)基，細胞沒遷移過去，下層小室FBS是不是含量越低越好。 3、還有就是transwell小室實驗前需不需要怎么處理一下，比如用無血清培養(yǎng)基浸潤半個小時什么的。 4、加完細胞懸液后一般多長時間染色觀察，我看文獻有說5h，但是我覺得5h根本都遷移不過去。 |
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wizardfan: 金幣+3, 應助指數(shù)+1, 很詳細的回答 2012-09-30 08:04:58
boylover123: 金幣+4, 謝謝你的回答，很詳細，很受用 2013-01-11 20:39:25
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遷移和侵襲我都做過，我來答吧： 1、上層小室加的細胞懸液為什么要含0.5%的BSA，BSA的作用是什么。 答：是為了保持滲透壓，不至于讓上室的水分滲透到下室太多，影響了藥物濃度（如果加藥的話）和實驗結(jié)果。也可以用1%的FBS。 2、下層我用的是含5%FBS的培養(yǎng)基，曾經(jīng)用過0.4%FBS的培養(yǎng)基，細胞沒遷移過去，下層小室FBS是不是含量越低越好。 不是，上室FBS含量要低于下室，F(xiàn)BS里除含有養(yǎng)分外，也含有趨化因子，F(xiàn)BS濃度差是細胞遷移的誘導動力。如無特殊要求，下室濃度可用細胞培養(yǎng)液中FBS的濃度，即10%。 3、還有就是transwell小室實驗前需不需要怎么處理一下，比如用無血清培養(yǎng)基浸潤半個小時什么的。 如果是遷移的話不用；如果是侵襲實驗的話，因為transwell小室上鋪有Matrigel，所以要無血清培養(yǎng)基侵潤一到兩個小時，叫做“水化基底膜” 4、加完細胞懸液后一般多長時間染色觀察，我看文獻有說5h，但是我覺得5h根本都遷移不過去。 這個要看細胞的遷移能力了。如果用的是正常細胞，如表皮細胞、成纖維細胞、內(nèi)皮細胞等，其遷移能力較弱，需要24小時甚至更長的時間；如果是腫瘤細胞，則較快；如果是高度惡性腫瘤細胞（就是高轉(zhuǎn)移腫瘤，比如人的卵巢癌、膀胱癌等），遷移能力很強，5、6個小時就能遷移過去。并且，這個跟所種的細胞數(shù)也相關，需要摸一下條件。宗旨就是：在遷移時間內(nèi)，陰性對照組（不加藥的情況下）只有部分細胞遷移到下室，而不是全部。我的意思是，如果時間過長，全部細胞慢慢挪，是可以都挪到下室的，這樣可能導致陰性組和加藥組看不出應有的差別來。當然過短也不行，只有極少的細胞遷移了，結(jié)果還是不明顯，所以需要摸一下條件。 另外囑咐幾點： 一是，實驗結(jié)束染色后，別忘了單獨觀察一下下室中是否有掉落的細胞，有時實驗細胞數(shù)較多或?qū)嶒灂r間較長（比如超過24小時），細胞在小室的底部粘不牢，掉到下室去，未能被染色，影響統(tǒng)計結(jié)果。若有，則下次實驗可在上室底部包被FN（纖維粘連蛋白），增強粘附。尤其是用正常細胞的時候。 二是，實驗結(jié)束后，盡快染色，勿讓細胞風干，否則細胞會有破裂的現(xiàn)象，染完色后在顯微鏡下不好看，爛乎乎的。在這里提示一個小tip：如果用結(jié)晶紫染色，感覺細胞很多怕計數(shù)不準的話，可以用醋酸將結(jié)晶紫洗下，上酶標儀讀OD（我一時忘了波長了，這個可以查一下），用以輔助驗證結(jié)果。這里醋酸洗掉的只是結(jié)晶紫，細胞還在，還可以再次用結(jié)晶紫復染，顯微鏡下看，效果與初染幾無差別 |
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14樓2012-09-29 23:36:07
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
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好久了啊，呵呵 我記得應該是這樣的：首先遷移的細胞要大致均勻，否則怎么都不好選（如果是侵襲實驗，那么嚴重不均勻的實驗結(jié)果本身也不可信，因為相當于某處穿了一個“洞”，然后剩下的細胞就不必降解基底膜了，直接麻溜地聚集到那里鉆過去就行了）；大致均勻的前提下，選取某條直徑上的五個視野拍照，然后計數(shù)，取平均值，這是一次；再選取另一條直徑，結(jié)果作為第二次；第三次相同。三次的計數(shù)除以陰性對照組的計數(shù)（方法相同），得到的百分率即為遷移率。然后三次計算得到的遷移率取平均值，算標準差，得到最后結(jié)果 這是最嚴謹?shù)囊环N~~ |
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26樓2015-09-07 18:53:57
2樓2012-09-29 11:52:51
3樓2012-09-29 16:37:45
6樓2012-09-29 17:47:01
9樓2012-09-29 20:39:01
10樓2012-09-29 21:02:01
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boylover123(金幣+1): 謝謝參與
wizardfan: 金幣+3, 鼓勵發(fā)帖交流 2012-09-30 08:05:12
boylover123(金幣+1): 謝謝參與
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遷移就是要觀察癌細胞或具有遷移能力的細胞從營養(yǎng)貧瘠處往豐富處遷移的能力。 1、第一個問題：加BSA的作用就是要模擬小室下層加的FBS的環(huán)境，保證實驗的嚴謹性。 2、第二個問題：FBS用平常正常的比例就行，平常應該都是10%的FBS。0.4明顯太小了，跟沒加一樣，細胞當然不容易遷移過去。 3、在細胞懸液加到小室前，需要事先浸潤。我之前就是直接浸潤在有加FBS的培養(yǎng)基。不過我認為你說的應該更嚴謹些。 4、不同細胞的遷移能力不同。所以需要事先做個時間梯度，把握下大概的時間。通常我控制在10個小時左右。 |
13樓2012-09-29 23:11:05
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27樓2015-09-08 11:58:01
28樓2018-06-07 09:10:07
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
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29樓2018-08-11 19:27:36
簡單回復
2012-09-29 16:59
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boylover123(金幣+1): 謝謝參與
xiejf5樓
2012-09-29 17:46
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boylover123(金幣+1): 謝謝參與
2012-09-29 19:18
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boylover123(金幣+1): 謝謝參與
江南的竹8樓
2012-09-29 19:36
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boylover123(金幣+1): 謝謝參與
104688987711樓
2012-09-29 21:13
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boylover123(金幣+1): 謝謝參與
101020507512樓
2012-09-29 21:41
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boylover123(金幣+1): 謝謝參與
wizardfan15樓
2012-09-30 08:04
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boylover123(金幣+1): 謝謝參與
janezqf21樓
2013-03-20 16:52
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