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綠草如茵木蟲 (小有名氣)
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[求助]
求原位雜交的技術(shù)protocol
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| 大家好，本人最近想做植物組織切片的原位雜交，以前做過(guò)都失敗了，現(xiàn)在還需要做，求具體的操作流程，謝謝！不勝感激！ |
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chenguestc
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7樓2012-10-24 15:42:17
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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1. 制片 2. 制片處理：滴加50-100µL 70%的甲酰胺（用2×SSC配置），蓋上蓋片。 80℃處理2min, 拿出后迅速甩掉蓋片。迅速依次放到-20℃預(yù)冷的梯度酒精中（70%，95%，100%酒精各5min或以上）。 3. 處理完自然干燥。 4. 配置雜交體系： 去離子甲酰胺 7.5µL 20×SSC 1.5µL ssDNA（鮭魚精DNA） 1.5µL B-DNA（封阻） 1µL 50%DS(葡聚糖) 3µL Probe(最后關(guān)燈加) 1µL 上述體系配置完成后，瞬時(shí)離心（閉光），然后80℃變性10min。變性完后，迅速放到冰上處理5min以上。 5. 把上述體系滴加到玻片上，蓋片，然后周圍涂上無(wú)色指甲油保溫密封。放入37℃飯盒里反應(yīng)8h以上或過(guò)夜。 6. 用鑷子將指甲油剝掉，將標(biāo)本片浸入2×SSC的染色缸中，輕輕搖動(dòng)使蓋片脫落。 7. 再按照下列步驟清洗： 2×SSC 室溫 5min 2×SSC 42℃ 10min 2×SSC 室溫 5min 1×PBS 室溫 5min 離心管中加入0.5-1%抗小牛血清（用1×PBS配置）100µL，再加入1µL Fab,斡旋混勻，滴加到蓋片上（滴加時(shí)標(biāo)本不要太干燥），蓋上蓋片，37℃條件下，45min或以上。 8. 按照步驟7清洗 9. 自然閉光干燥后滴加PI，蓋上蓋片鏡檢。 |
2樓2012-10-18 11:03:40
綠草如茵
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3樓2012-10-18 12:58:02
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4樓2012-10-18 13:00:36
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