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[求助]
【求助】微生物磷脂脂肪酸測(cè)定分析方法（PLFA）
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急求微生物磷脂脂肪酸（PLFA）測(cè)定分析方法的具體步驟 剛步入研究生活，各方面搜集資料的能力還有限，要開(kāi)題了，比較頭大。 現(xiàn)在需要確定實(shí)驗(yàn)計(jì)劃了，要測(cè)PLFA。上網(wǎng)查了，發(fā)現(xiàn)各實(shí)驗(yàn)方法都有不一樣的地方，現(xiàn)想尋求一種已實(shí)驗(yàn)過(guò)的較成熟方法。 謝謝各位學(xué)術(shù)哥哥姐姐了~~ |
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2樓2012-10-23 15:24:37
3樓2012-11-05 17:01:19
shouhuweilai
木蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)
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4樓2012-11-05 17:25:31
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5樓2012-11-29 18:55:24
【答案】應(yīng)助回帖
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方法一： 1) 取 5 g（精確至 0.01 g）大曲樣品于 50 mL 離心管中加 25 mL Bligh-Dyer 提取 液，充分搖勻，離心管用錫紙包裹，4℃靜置過(guò)夜，分層。 2) 向離心管中加 7.5 mL 氯仿，7.5 mL 檸檬酸緩沖液，搖勻后，4℃靜置過(guò)夜。 3) 4000 r/min 室溫離心 10 min，用無(wú)菌一次性吸管小心吸掉上清液，下層用濾 紙過(guò)濾至錫紙包裹的小三角瓶中，高純氮?dú)獯蹈伞?br /> 4) 用氯仿沖洗小柱，將活化后的硅膠（事先在 105℃烘干 1h，冷卻至室溫）加 一定量的氯仿浸泡，用膠頭吸管吸入柱中，注意滴加過(guò)程要緩慢，不要產(chǎn)生 氣泡，并保持柱子液面水平，上層氯仿高出柱子液面一部分以免柱子干涸， 底部連接橡皮管，并用夾子旋緊靜置 1~2h。 5) 待柱子穩(wěn)定后再用氯仿小心重洗柱子，在樣品三角瓶中加 300 μL 氯仿溶解樣 品，用吸管轉(zhuǎn)移至柱中，分別用 10 mL 氯仿、10 mL 丙酮洗柱，10 mL 無(wú)水 甲醇對(duì)樣品進(jìn)行洗脫，加無(wú)水甲醇后，開(kāi)始用試管接收樣品，并用高純氮?dú)?br /> 吹干。 6) 往試管中加 1 mL 甲醇甲苯混合液（1:1，V/V）和 1 mL 0.2 mol/L 氫氧化鉀 甲醇溶液，37℃，水浴 15 min。 7) 再加 0.3 mL 1 mol/L 乙酸、2 mL 正己烷氯仿混合液和 2 mL 滅菌去離子水， 振蕩分離，靜置 1 h 分層。 8) 將上層小心轉(zhuǎn)移至另一試管中，高純氮?dú)獯蹈桑?br /> 9) 加入 2 mL 含 33 μg/mL 內(nèi)標(biāo)十九烷酸甲基酯（nonadecanoic acid methyl ester） 的有機(jī)溶劑正己烷，用注射器經(jīng)有機(jī)相濾膜過(guò)濾后注入樣品瓶，上機(jī)待測(cè)。 方法二： 1) 取 5 g（稱(chēng)準(zhǔn)至 0.01 g）大曲樣品于 50 mL 離心管中加 25 mL Bligh-Dyer 提取 液，充分搖勻，離心管用錫紙包裹，4℃靜置過(guò)夜，分層。 2) 將上清轉(zhuǎn)移至新的用錫箔紙包裹的離心管中，加入 7.5 mL 氯仿，7.5 mL 檸 檬酸緩沖液，混勻，4℃靜置過(guò)夜； 3) 4000 r/min 離心 10 min，收集下層溶液，合并兩次的下層溶液； 4) 剩下步驟同方法一 3）~9） 方法三： 1) 取 5 g（稱(chēng)準(zhǔn)至 0.01 g）大曲樣品于 50 mL 離心管中加 25 mLBligh-Dyer 提取 液，離心管用錫紙包裹，250 r/min 振蕩提取 2 h； 2) 2000 r/min 離心 10 min，上清轉(zhuǎn)移至以新的用錫箔紙包裹的離心管中。下層 固體在加入 7.5 mL 氯仿，7.5 mL 檸檬酸緩沖液 250 r/min 振蕩提取 2 h，2500 r/min 離心 10 min，取上清，合并上清溶液； 3) 向上清溶液加入 5 mL 氯仿，5 mL 檸檬酸緩沖液，搖勻后，4℃靜置過(guò)夜； 4) 剩下步驟同方法一中 3）~9） 1.3.2 樣品水分和堆積樣品取樣溫度的測(cè)定 樣品水分含量的測(cè)定按照沈怡方 [78] 的方法，計(jì)算樣品的絕對(duì)干重。堆積樣品 取樣點(diǎn)溫度的測(cè)定：每次取樣前先用溫度計(jì)插入取樣點(diǎn)，待讀數(shù)穩(wěn)定后讀數(shù)，并 計(jì)算 3 個(gè)取樣點(diǎn)的平均溫度。 1.3.3 PLFA 的 GC-MS 檢測(cè) 提取各樣品的 PLFA 后，用 Agilent 6890N 氣-質(zhì)聯(lián)用儀測(cè)定樣品 PLFA 的含 量。 1.3.3.1 色譜條件 色譜柱： HP-5MS (30. 0 m ×250 μm×0. 25 μm) 載氣類(lèi)型：高純氮?dú)?br /> 流速： 1.5 mL/min 進(jìn)樣量：1 μL 分流比：10:1 升溫程序：初始溫度 50℃維持 1 min,分 4 個(gè)階段程序性升溫: 50～180℃, 12 ℃/min,保持 2 min; 180～220 ℃, 6 ℃/min,保持 2 min; 220～240 ℃, 15 ℃ /min,保持 1 min; 240～260 ℃, 15 ℃/min,保持 15 min。 1.3.3.2 質(zhì)譜條件 連接口溫度：250℃ 電離方式：EI 電子能量：70 eV 離子源溫度：200℃ 我用的是方法一效果不錯(cuò)哦 |
6樓2013-07-29 21:02:46
15834741652
銀蟲(chóng) (小有名氣)
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7樓2014-11-28 19:44:41
cynlicious
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8樓2015-09-10 20:41:46
Moonyleeeee
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你好，研一小白一枚，最近老板把提取磷脂脂肪酸的活交給了我，可惜第一次做這種實(shí)驗(yàn)，看了相關(guān)文獻(xiàn)大致確定了實(shí)驗(yàn)方案，可其中有的實(shí)驗(yàn)步驟不是很懂。提取磷脂脂肪酸的時(shí)候?yàn)槭裁匆欢ㄒ玫獨(dú)獯蹈裳�？還有關(guān)于SPE柱的問(wèn)題，SPE柱是否可以重復(fù)利用，如果可以重復(fù)利用，一根柱子每次加入不同量的樣品，每次用過(guò)之后是否得進(jìn)行沖洗？還有SPE柱的具體使用方法是什么樣的，看的文獻(xiàn)里說(shuō)的都比較籠統(tǒng)。麻煩大神了 |
9樓2017-11-08 19:57:02
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