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[求助]
【求助】微生物磷脂脂肪酸測定分析方法（PLFA）
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急求微生物磷脂脂肪酸（PLFA）測定分析方法的具體步驟 剛步入研究生活，各方面搜集資料的能力還有限，要開題了，比較頭大。 現(xiàn)在需要確定實驗計劃了，要測PLFA。上網(wǎng)查了，發(fā)現(xiàn)各實驗方法都有不一樣的地方，現(xiàn)想尋求一種已實驗過的較成熟方法。 謝謝各位學(xué)術(shù)哥哥姐姐了~~ |
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15834741652
銀蟲 (小有名氣)
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- 在線: 32.7小時
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- 注冊: 2013-11-22
- 性別: GG
- 專業(yè): 自然地理學(xué)
7樓2014-11-28 19:44:41
2樓2012-10-23 15:24:37
3樓2012-11-05 17:01:19
【答案】應(yīng)助回帖
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方法一： 1) 取 5 g（精確至 0.01 g）大曲樣品于 50 mL 離心管中加 25 mL Bligh-Dyer 提取 液，充分搖勻，離心管用錫紙包裹，4℃靜置過夜，分層。 2) 向離心管中加 7.5 mL 氯仿，7.5 mL 檸檬酸緩沖液，搖勻后，4℃靜置過夜。 3) 4000 r/min 室溫離心 10 min，用無菌一次性吸管小心吸掉上清液，下層用濾 紙過濾至錫紙包裹的小三角瓶中，高純氮氣吹干。 4) 用氯仿沖洗小柱，將活化后的硅膠（事先在 105℃烘干 1h，冷卻至室溫）加 一定量的氯仿浸泡，用膠頭吸管吸入柱中，注意滴加過程要緩慢，不要產(chǎn)生 氣泡，并保持柱子液面水平，上層氯仿高出柱子液面一部分以免柱子干涸， 底部連接橡皮管，并用夾子旋緊靜置 1~2h。 5) 待柱子穩(wěn)定后再用氯仿小心重洗柱子，在樣品三角瓶中加 300 μL 氯仿溶解樣 品，用吸管轉(zhuǎn)移至柱中，分別用 10 mL 氯仿、10 mL 丙酮洗柱，10 mL 無水 甲醇對樣品進(jìn)行洗脫，加無水甲醇后，開始用試管接收樣品，并用高純氮氣 吹干。 6) 往試管中加 1 mL 甲醇甲苯混合液（1:1，V/V）和 1 mL 0.2 mol/L 氫氧化鉀 甲醇溶液，37℃，水浴 15 min。 7) 再加 0.3 mL 1 mol/L 乙酸、2 mL 正己烷氯仿混合液和 2 mL 滅菌去離子水， 振蕩分離，靜置 1 h 分層。 8) 將上層小心轉(zhuǎn)移至另一試管中，高純氮氣吹干， 9) 加入 2 mL 含 33 μg/mL 內(nèi)標(biāo)十九烷酸甲基酯（nonadecanoic acid methyl ester） 的有機(jī)溶劑正己烷，用注射器經(jīng)有機(jī)相濾膜過濾后注入樣品瓶，上機(jī)待測。 方法二： 1) 取 5 g（稱準(zhǔn)至 0.01 g）大曲樣品于 50 mL 離心管中加 25 mL Bligh-Dyer 提取 液，充分搖勻，離心管用錫紙包裹，4℃靜置過夜，分層。 2) 將上清轉(zhuǎn)移至新的用錫箔紙包裹的離心管中，加入 7.5 mL 氯仿，7.5 mL 檸 檬酸緩沖液，混勻，4℃靜置過夜； 3) 4000 r/min 離心 10 min，收集下層溶液，合并兩次的下層溶液； 4) 剩下步驟同方法一 3）~9） 方法三： 1) 取 5 g（稱準(zhǔn)至 0.01 g）大曲樣品于 50 mL 離心管中加 25 mLBligh-Dyer 提取 液，離心管用錫紙包裹，250 r/min 振蕩提取 2 h； 2) 2000 r/min 離心 10 min，上清轉(zhuǎn)移至以新的用錫箔紙包裹的離心管中。下層 固體在加入 7.5 mL 氯仿，7.5 mL 檸檬酸緩沖液 250 r/min 振蕩提取 2 h，2500 r/min 離心 10 min，取上清，合并上清溶液； 3) 向上清溶液加入 5 mL 氯仿，5 mL 檸檬酸緩沖液，搖勻后，4℃靜置過夜； 4) 剩下步驟同方法一中 3）~9） 1.3.2 樣品水分和堆積樣品取樣溫度的測定 樣品水分含量的測定按照沈怡方 [78] 的方法，計算樣品的絕對干重。堆積樣品 取樣點溫度的測定：每次取樣前先用溫度計插入取樣點，待讀數(shù)穩(wěn)定后讀數(shù)，并 計算 3 個取樣點的平均溫度。 1.3.3 PLFA 的 GC-MS 檢測 提取各樣品的 PLFA 后，用 Agilent 6890N 氣-質(zhì)聯(lián)用儀測定樣品 PLFA 的含 量。 1.3.3.1 色譜條件 色譜柱： HP-5MS (30. 0 m ×250 μm×0. 25 μm) 載氣類型：高純氮氣 流速： 1.5 mL/min 進(jìn)樣量：1 μL 分流比：10:1 升溫程序：初始溫度 50℃維持 1 min,分 4 個階段程序性升溫: 50～180℃, 12 ℃/min,保持 2 min; 180～220 ℃, 6 ℃/min,保持 2 min; 220～240 ℃, 15 ℃ /min,保持 1 min; 240～260 ℃, 15 ℃/min,保持 15 min。 1.3.3.2 質(zhì)譜條件 連接口溫度：250℃ 電離方式：EI 電子能量：70 eV 離子源溫度：200℃ 我用的是方法一效果不錯哦 |
6樓2013-07-29 21:02:46
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