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尚軒舞雪銀蟲(chóng) (小有名氣)
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原核表達(dá)引物設(shè)計(jì)的問(wèn)題
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我要原核表達(dá)一個(gè)蛋白質(zhì)，表達(dá)載體是PET-32a（+），現(xiàn)有下面幾個(gè)問(wèn)題要請(qǐng)教一下： 1. 設(shè)計(jì)引物的時(shí)候需不需要去掉終止子（TAA）和起始子（ATG）？ 2. 我用的酶切位點(diǎn)是EcoRI和XhoI，這兩個(gè)酶切位點(diǎn)前加幾個(gè)保護(hù)堿基合適并且不會(huì)造成譯碼突變? 3. 另外我不打算純化表達(dá)的蛋白，只是做個(gè)SDS-PAGE電泳和Western驗(yàn)證下抗體的特異性，所以我表達(dá)蛋白時(shí)是做個(gè)全長(zhǎng)ORF的，還是一個(gè)肽段序列比較好？ 4. 原核表達(dá)蛋白的大小應(yīng)該怎么確定？ 各位大俠幫我一下，我身邊的人都不做這方面的實(shí)驗(yàn)，所以做起來(lái)問(wèn)題很多，望大家?guī)臀乙幌? |
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尚軒舞雪
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【答案】應(yīng)助回帖
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小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2012-10-29 16:06:08
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設(shè)計(jì)引物不一定要去掉終止子和起始子，這需要看你表達(dá)載體的特性，這個(gè)載體我沒(méi)用過(guò)不太清楚 一般來(lái)說(shuō)在酶切位點(diǎn)之前加保護(hù)堿基不會(huì)造成譯碼突變，因?yàn)槟忝盖械臅r(shí)候都能切掉 一般不建議一個(gè)肽段，如果能知道某個(gè)肽段是抗原決定簇也可以 蛋白大小=堿基數(shù)X110／３ |
2樓2012-10-29 15:56:52
尚軒舞雪
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3樓2012-10-30 10:26:57
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4樓2012-11-01 09:43:05
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