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原核表達(dá)引物設(shè)計的問題
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我要原核表達(dá)一個蛋白質(zhì)，表達(dá)載體是PET-32a（+），現(xiàn)有下面幾個問題要請教一下： 1. 設(shè)計引物的時候需不需要去掉終止子（TAA）和起始子（ATG）？ 2. 我用的酶切位點(diǎn)是EcoRI和XhoI，這兩個酶切位點(diǎn)前加幾個保護(hù)堿基合適并且不會造成譯碼突變? 3. 另外我不打算純化表達(dá)的蛋白，只是做個SDS-PAGE電泳和Western驗(yàn)證下抗體的特異性，所以我表達(dá)蛋白時是做個全長ORF的，還是一個肽段序列比較好？ 4. 原核表達(dá)蛋白的大小應(yīng)該怎么確定？ 各位大俠幫我一下，我身邊的人都不做這方面的實(shí)驗(yàn)，所以做起來問題很多，望大家?guī)臀乙幌? |
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xj0311
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尚軒舞雪: 金幣+8, ★★★★★最佳答案, 謝謝，學(xué)習(xí)了 2012-11-03 09:11:54
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pet32a這個載體好像有189個氨基酸，約20KD，pET-32a空載體表達(dá)的蛋白序列如下：MSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAEWCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLNIDQNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLAGSGSGHMHHHHHHSSGLVPRGSGMKETAAAKFERQHMDSPDLGTDDDDKAMADIGSEFELRRQACGRTRAPPPPPLRSGC 保護(hù)位點(diǎn)堿基數(shù)目幾個都無所謂，酶切就掉了。 最好表達(dá)全長，只是多肽的話，理論上，如果你的抗體不是針對這個表位產(chǎn)生的抗體，那WB就是隱形哦，所以表達(dá)蛋白可以稍微大些，抗原表位就多些，得到陽性信號的可能性大些。 |
7樓2012-11-02 11:31:58
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