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axiye新蟲 (小有名氣)
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[求助]
real time PCR NTC 陽性擴(kuò)增
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| 最近在做real time PCR實(shí)驗(yàn)，突然有一次發(fā)現(xiàn)用模板10倍稀釋所做的標(biāo)準(zhǔn)曲線完全不標(biāo)準(zhǔn)，后來發(fā)現(xiàn)無模板對照也有陽性擴(kuò)增，拿回來跑膠發(fā)現(xiàn)是目的片段，切膠回收測序也沒有問題，有沒有兄弟姐妹遇到過這種問題啊，都是怎么解決的呢？做了快一個(gè)月了，仍找不到具體原因，希望高手能夠解答！ |
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blackrose8089
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4樓2012-10-30 20:16:55
zhwenxing
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axiye: 金幣+10, ★有幫助 2013-02-25 13:42:19
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1、樓主的問題其實(shí)挺籠統(tǒng)的，N有條帶，還是目的片段，說明模板混入了哈，氣溶膠？用的槍吸入污染？都有可能 2、稀釋10倍跑的不準(zhǔn)，注意稀釋液和稀釋倍數(shù)的準(zhǔn)確性 3、跑一下內(nèi)參，看看是技術(shù)操作問題，還是PCR體系問題。 4、除了問題，重復(fù)兩次后仍然有同樣的問題，就先停止試驗(yàn)，好好去查查文獻(xiàn)。注意，Qpcr的移液器我們都是單獨(dú)使用的！包括加內(nèi)參的、N的都是單獨(dú)用！一般是先配出N來！ |
2樓2012-10-30 15:29:49
caoxin1984
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3樓2012-10-30 20:13:08
axiye
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我用了實(shí)驗(yàn)室其他人的引物，同樣的條件，也是可以P出來，是不是因?yàn)檠h(huán)數(shù)（40個(gè)）太多導(dǎo)致？但是realtime PCR不都是需要40個(gè)循環(huán)的嗎？ 我嘗試過在超凈臺做過，所有的試劑都是新的，槍頭、PCR管等用到的都是滅菌或殺過菌的，一樣能P得出來，在外邊和里邊做沒區(qū)別，我直覺不是污染的問題。 論壇中About PCR那個(gè)貼子我也看過，也有這樣的問題，樓主說最后改變了退火溫度就好了，我還嘗試了60-70的溫度梯度PCR，發(fā)現(xiàn)接近70度時(shí)，目的條帶才慢慢變少了，但還是有，是不是引物的問題啊，需要重新設(shè)計(jì)會不會好些？ |
5樓2012-10-30 21:24:49
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