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新蟲 (初入文壇)

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專業(yè): 免疫學(xué)研究新技術(shù)與新方法

[求助] CTAB法提取乳酸菌DNA后電泳圖有多條帶事怎么回事？

本人用CTAB法提取乳酸菌DNA，marker右邊的5個泳道是加了溶菌酶處理的菌株，為何后面會有條帶？做16S是否有影響？
具體步驟如下：
（1）每個離心管加1500ul培養(yǎng)物
（2）將上述裝有培養(yǎng)物的離心管放入離心機(jī)離心5分鐘（8000轉(zhuǎn)/s）
（3）棄上清，再加1500ul培養(yǎng)物，混勻，放入離心機(jī)離心5分鐘（8000轉(zhuǎn)/s）
（4）棄上清，加1mLTE緩沖液與沉淀物充分混勻，離心5分鐘(達(dá)到洗滌細(xì)菌沉淀物的目的)
（5）棄上清，取567ulTE緩沖液置各有細(xì)菌沉淀物的小管，蓋上蓋子后放到震蕩機(jī)上進(jìn)行震蕩或用移液槍吸推將其混勻
（6）加30ul10％SDS
（7）加3ul20mol/L蛋白酶K，輕輕顛倒混勻
（8）放入37℃烘箱1h
（9）加入100ul5mol/L的NaCL溶液，蓋上蓋子輕輕混勻
（10）加入80ulCTAB NaCL溶液，蓋上蓋子輕輕混勻
（11）65℃水浴10分鐘
（12）加入800ul酚/氯仿/異戊醇，輕輕混勻（去除蛋白質(zhì)和其他大分子物質(zhì)）
（13）12000轉(zhuǎn)/s離心5分鐘
（14）取上清液（上層為蛋白質(zhì)，下層為苯酚）放入對應(yīng)的新的離心管
（15）再次加入500ul/L酚/氯仿/異戊醇溶液
（16）再次離心5分鐘
注：若15步的離心界面層的蛋白質(zhì)很少且分層較明顯，可省略17、18兩步
（17）用移液槍取出500ul左右的上清液置對應(yīng)的新的離心管，加2倍體積的無水乙醇和1/10的3mol/L NaAC
（18）離心，將DNA沉淀到小管底部
（19）倒去上清液，只留底部DNA沉淀，向各管加500ul70％乙醇（洗滌DNA）
（20）12000轉(zhuǎn)/s離心5分鐘
（21）棄上清液，晾干，重溶于30ul的TE緩沖液
（22）加入1ulRNA酶，37℃消化1小時
（23）DNA樣品在-20℃保存?zhèn)溆?br /> marker（3000）右邊5個泳道在第6步前加入10微升10mg/mL的溶菌酶，希望各位大俠幫忙解釋下，或者提供該方法不足之處，謝謝！

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附件 1 : 2012.10.30.BMP

2012-10-30 19:12:18, 433.05 K

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1樓 2012-10-30 19:18:15

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