caidongjie

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[交流] 外源基因連接載體

請教各位大俠：為什么我連接以后的重組載體質(zhì)粒PCR有目的條帶，但是酶切后什么條帶都沒有，質(zhì)粒跑電泳也沒有條帶，做PCR時(shí)用的是一個(gè)重組質(zhì)粒，我的酶切位點(diǎn)是Hind3和Xba1，表達(dá)載體是pMG36e。。。。。求助各位大俠們。。。。。

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1樓 2012-11-09 17:29:14

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竹子小小

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質(zhì)粒跑電泳都沒有帶那就是你質(zhì)粒沒提出來

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caidongjie

2樓2012-11-09 17:44:54

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質(zhì)粒的濃度太低了，重新提，菌體量大點(diǎn)

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caidongjie

7樓2012-11-11 11:22:28

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caidongjie

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2樓: Originally posted by 竹子小小 at 2012-11-09 17:44:54
質(zhì)粒跑電泳都沒有帶那就是你質(zhì)粒沒提出來

謝謝，我用8微升的質(zhì)粒跑的電泳，可能濃度太低了，PCR只用2微升但是條帶很亮，郁悶

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8樓2012-11-11 18:54:56

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7樓: Originally posted by liuan6126 at 2012-11-11 11:22:28
質(zhì)粒的濃度太低了，重新提，菌體量大點(diǎn)

謝謝，我平時(shí)用5毫升菌液提的，還需要增加菌體量嗎？增加多少

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9樓2012-11-11 18:55:55

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apple6299

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PCR會存在假陽性的現(xiàn)象，一般不太可靠。最好的方法就是，先提取質(zhì)粒，電泳，看下大小是否是正確的，大小正確之后，選擇合適位點(diǎn)進(jìn)行酶切驗(yàn)證，酶切后得到的片段大小與預(yù)測大小正確后，最好送去測序公司測下序，從而可以判斷重組載體是否建立成功

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10樓2012-11-12 19:07:13

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jl860822

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質(zhì)粒有問題�。�

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11樓2012-11-12 20:37:53

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10樓: Originally posted by apple6299 at 2012-11-12 19:07:13
PCR會存在假陽性的現(xiàn)象，一般不太可靠。最好的方法就是，先提取質(zhì)粒，電泳，看下大小是否是正確的，大小正確之后，選擇合適位點(diǎn)進(jìn)行酶切驗(yàn)證，酶切后得到的片段大小與預(yù)測大小正確后，最好送去測序公司測下序，從而 ...

謝謝您！我提質(zhì)粒跑電泳沒有條帶啊，酶切的時(shí)候什么條帶都沒有，是質(zhì)粒濃度低嗎？

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12樓2012-11-12 20:45:39

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liuan6126

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9樓: Originally posted by caidongjie at 2012-11-11 18:55:55
謝謝，我平時(shí)用5毫升菌液提的，還需要增加菌體量嗎？增加多少...

這個(gè)5 ml也不大好講，畢竟OD600可能不同，現(xiàn)在你PCR出來，但質(zhì)粒酶切沒條帶，估計(jì)你提完質(zhì)粒沒跑電泳看看濃度。
建議：菌體量大點(diǎn)，提完質(zhì)粒3 ul電泳看看濃度。PS：冬天有些時(shí)候質(zhì)粒提不出來，建議第二步裂解在37°水浴里3min.

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13樓2012-11-13 13:57:27

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smdsfy

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小丹木木: 金幣+2, 鼓勵交流 2012-11-14 16:38:29

PCR驗(yàn)證要陽性對照和陰性對照，最好是做雙酶切，首先你的質(zhì)粒沒提出來，是不是菌的問題，或是哪個(gè)試劑的問題，把你以前做成功的質(zhì)粒一起做，做個(gè)陽性對照，這樣能找出問題在哪

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14樓2012-11-13 14:26:29

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caidongjie

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14樓: Originally posted by smdsfy at 2012-11-13 14:26:29
PCR驗(yàn)證要陽性對照和陰性對照，最好是做雙酶切，首先你的質(zhì)粒沒提出來，是不是菌的問題，或是哪個(gè)試劑的問題，把你以前做成功的質(zhì)粒一起做，做個(gè)陽性對照，這樣能找出問題在哪

恩恩謝謝這些我都在考慮，慢慢排查吧，這個(gè)質(zhì)粒也確實(shí)難做啊

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15樓2012-11-14 09:28:45

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13樓: Originally posted by liuan6126 at 2012-11-13 13:57:27
這個(gè)5 ml也不大好講，畢竟OD600可能不同，現(xiàn)在你PCR出來，但質(zhì)粒酶切沒條帶，估計(jì)你提完質(zhì)粒沒跑電泳看看濃度。
建議：菌體量大點(diǎn)，提完質(zhì)粒3 ul電泳看看濃度。PS：冬天有些時(shí)候質(zhì)粒提不出來，建議第二步裂解在37 ...

恩恩，十分感謝，我再試試看，不行就得重頭做了，腦袋都大了

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16樓2012-11-14 09:30:59

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qi_yongbin

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做克隆遇到這種問題很正常，PCR驗(yàn)證一般來說還是可以的，但是你一定要設(shè)置陰性和陽性兩個(gè)對照，不知道的你的載體有多大？酶切的目的條帶有多大？如果是小片段，酶切后電泳也很難看到，建議直接送測序再說！

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17樓2012-11-14 10:26:03

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Marado

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不知道為嘛很多人都不喜歡用酶切去驗(yàn)證，PCR驗(yàn)證是個(gè)假陽性概率挺高的方法，只能作為初步篩選疑似陽性菌株，不能作為確定手段.
你這個(gè)明顯是質(zhì)粒沒有提取成功，按道理5ml的菌液提取出的質(zhì)粒量很足的，只要菌液不是太稀，點(diǎn)個(gè)5ul應(yīng)該就可以看得很清晰，你還是先從質(zhì)粒提取上找原因吧，質(zhì)粒提取電泳都沒條帶……還做什么酶切呢？

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18樓2012-11-14 15:03:37

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ph031810213樓

2012-11-09 18:18 回復(fù)

caidongjie(金幣+5): 謝謝參與

頂一下

7792675374樓

2012-11-09 18:19 回復(fù)

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張咖喱5樓

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advancelove6樓

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