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porphybaby金蟲 (正式寫手)
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[求助]
為什么SDS-PAGE膠在做膠的時(shí)候會出現(xiàn)不均勻的條紋？ 已有1人參與
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RT 我已經(jīng)試了很多次了 我可以確定 做膠的玻璃片我洗的非常干凈 不掛水珠 然后 做膠的配方 啊那些 都是按量加入 并且 充分混勻的了 可是 它每次都會凝成一圈圈的 出現(xiàn)很多 不均勻 的 花紋 條帶 一道一道的 請問這是怎么回事？最近幾乎每一次都會遇到�。≌垎柸绾谓鉀Q？ |
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9樓2012-12-06 15:06:04
【答案】應(yīng)助回帖
| ⒈ 配膠緩沖液系統(tǒng)對電泳的影響？ 在SDS－PAGE不連續(xù)電泳中，制膠緩沖液使用的是Tris－HCL緩沖系統(tǒng)，濃縮膠是pH6.7，分離膠pH8.9；而電泳緩沖液使用的Tris－甘氨酸緩沖系統(tǒng)。在濃縮膠中，其pH環(huán)境呈弱酸性，因此甘氨酸解離很少，其在電場的作用下，泳動效率低；而CL離子卻很高，兩者之間形成導(dǎo)電性較低的區(qū)帶，蛋白分子就介于二者之間泳動。由于導(dǎo)電性與電場強(qiáng)度成反比，這一區(qū)帶便形成了較高的電壓梯度，壓著蛋白質(zhì)分子聚集到一起，濃縮為一狹窄的區(qū)帶。當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠后，由于膠中pH的增加，呈堿性，甘氨酸大量解離，泳動速率增加，直接緊隨氯離子之后，同時(shí)由于分離膠孔徑的縮小，在電場的作用下，蛋白分子根據(jù)其固有的帶電性和分子大小進(jìn)行分離。 所以，pH對整個(gè)反應(yīng)體系的影響是至關(guān)重要的，實(shí)驗(yàn)中在排除其他因素之后仍不能很好解決問題的情況，應(yīng)首要考慮該因素，當(dāng)然其他的因素也可以從多方面考慮。 ⒉ 樣品如何處理？ 根據(jù)樣品分離目的不同，主要有三種處理方法：還原SDS處理、非還原SDS處理、帶有烷基化作用的還原SDS處理。 1）還原SDS處理：在上樣buffer中加入SDS和DTT（或Beta巰基乙醇）后，蛋白質(zhì)構(gòu)象被解離，電荷被中和，形成SDS與蛋白相結(jié)合的分子，在電泳中，只根據(jù)分子量來分離。一般電泳均按這種方式處理，樣品稀釋適當(dāng)濃度，加入上樣Buffer，離心，沸水煮5min，再離心加樣。 2）帶有烷基化作用的還原SDS處理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并經(jīng)久牢固的保護(hù)SH基團(tuán)，得到較窄的譜帶；另碘乙酸胺可捕集過量的DTT，而防止銀染時(shí)的紋理現(xiàn)象。100ul樣品緩沖液中10ul 20%的碘乙酸胺，并在室溫保溫30min。 3）非還原SDS處理：生理體液、血清、尿素等樣品，一般只用1%SDS沸水中煮3min，未加還原劑，因而蛋白折疊未被破壞，不可作為測定分子量來使用。 �、� SDS-PAGE電泳凝膠中各主要成分的作用？ 聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺與為蛋白質(zhì)電泳提供載體，其凝固的好壞直接關(guān)系到電泳成功與否，與促凝劑及環(huán)境密切相關(guān)； 制膠緩沖液：濃縮膠選擇pH6.7，分離膠選擇pH8.9，選擇tris－HCL系統(tǒng)，TEMED與AP：AP 催化劑，催化單丙和雙丙聚合成聚丙烯酰胺。TEMED 四甲基乙二胺，催凝劑，加速AP 催化作用；十二烷基磺酸鈉（SDS）：陰離子去污劑，作用有四：去蛋白質(zhì)電荷、解離蛋白質(zhì)之間的氫鍵、取消蛋白分子內(nèi)的疏水作用、去多肽折疊。 �、� 提高SDS-PAGE電泳分辨率的途徑？ 聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝膠的分辨率。建議做法：待凝膠在室溫凝固后，可在室溫下放置一段時(shí)間使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易導(dǎo)致凝固不充分，后者可導(dǎo)致SDS結(jié)晶。一般凝膠可在室溫下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。 一般常用的有氨基黑、考馬斯亮藍(lán)、銀染色三種染料，不同染料又各自不同的染色方法，具體可參照郭堯君編著的《蛋白質(zhì)電泳技術(shù)手冊》P82-103。 �、怠� 微笑”（兩邊翹起中間凹下）形帶原因？ 主要是由于凝膠的中間部分凝固不均勻所致，多出現(xiàn)于較厚的凝膠中。 處理辦法：待其充分凝固再作后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 �、� “皺眉”（兩邊向下中間鼓起）形帶原因？ 主要出現(xiàn)在蛋白質(zhì)垂直電泳槽中，一般是兩板之間的底部間隙氣泡未排除干凈。 處理辦法：可在兩板間加入適量緩沖液，以排除氣泡。 �、� 為什么帶出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象？ 主要是樣品融解效果不佳或分離膠濃度過大引起的。 處理辦法：加樣前離心；選擇適當(dāng)?shù)臉悠肪彌_液，加適量樣品促溶劑；電泳緩沖液時(shí)間過長，重新配制；降低凝膠濃度。 �、� 為什么帶出現(xiàn)紋理現(xiàn)象？ 主要是樣品不溶性顆粒引起的。 處理辦法：加樣前離心；加適量樣品促溶劑。 ⒐ 什么是“鬼帶”，如何處理？ “鬼帶”就是在跑大分子構(gòu)象復(fù)雜的蛋白質(zhì)分子時(shí)，常會出現(xiàn)在泳道頂端（有時(shí)在濃縮膠中）的一些大分子未知條帶或加樣孔底部有沉淀，主要由于還原劑在加熱的過程中被氧化而失去活性，致使原來被解離的蛋白質(zhì)分子重新折疊結(jié)合和亞基重新締合，聚合成大分子，其分子量要比目標(biāo)條帶大，有時(shí)不能進(jìn)入分離膠。但它卻于目標(biāo)條帶有相同的免疫學(xué)活性，在WB反應(yīng)中可見其能與目標(biāo)條帶對應(yīng)的抗體作用。 處理辦法：在加熱煮沸后，再添加適量的DTT或Beta巰基乙醇，以補(bǔ)充不足的還原劑；或可加適量EDTA來阻止還原劑的氧化。 �、� 為什么溴酚藍(lán)不能起到指示作用？ 我們在實(shí)驗(yàn)中常會遇到溴酚藍(lán)已跑出板底，但蛋白質(zhì)卻還未跑下來的現(xiàn)象。主要與緩沖液和分離膠的濃度有關(guān)。 處理辦法：更換正確pH值的Buffer；降低分離膠的濃度。 �、� 為什么電泳的條帶很粗？ 電泳中條帶很粗是常見的事，主要是未濃縮好的原因。 處理辦法：適當(dāng)增加濃縮膠的長度；保證濃縮膠貯液的pH正確(6.7）；適當(dāng)降低電壓； �、� 為什么電泳電壓很高而電流卻很低呢？ 這種現(xiàn)象一般初學(xué)者易出現(xiàn)。比如電壓50v以上，可電流卻在5mA以下。主要是由于電泳槽沒有正確裝配，電流未形成通路。包括：a.內(nèi)外槽裝反；b.外槽液過少；c.電泳槽底部的絕緣體未去掉（比如倒膠用的橡膠皮）。 處理辦法：電泳槽正確裝配即可。 �、� 濃縮膠與分離膠斷裂、板間有氣泡對電泳有影響嗎？ 這主要出現(xiàn)在初學(xué)者中，一般對電泳不會有太大的影響。前者主要原因是拔梳子用力不均勻或過猛所致；后者是由于在解除制膠的夾子后，板未壓緊而致空氣進(jìn)入引起的。 �、� 凝膠時(shí)間不對，或慢或快，怎么回事？ 通常膠在30MIN-1H內(nèi)凝。如果凝的太慢，可能是TEMED，APS劑量不夠或者失效。APS應(yīng)該現(xiàn)配現(xiàn)用，TEMED不穩(wěn)定，易被氧化成黃色。如果凝的太快，可能是APS和TEMED用量過多，此時(shí)膠太硬易裂，電泳時(shí)易燒膠。 �、� 電泳時(shí)間比正常要長？ 可能由于凝膠緩沖系統(tǒng)和電級緩沖系統(tǒng)地PH選擇錯(cuò)誤，即緩沖系統(tǒng)地PH和被分離物質(zhì)的等電點(diǎn)差別太小，或緩沖系統(tǒng)的離子強(qiáng)度太高。 �、婪蛛x膠加上后為什么要立即加水？ 加入分離膠后，立即覆一層雙蒸水，一是為了使分離膠界面保持水平，用水就可以把它壓平，使蛋白質(zhì)分子跑時(shí)在同一水平線上；二是阻止空氣中的氧氣對凝膠聚合的抑制作用。 �、吝B續(xù)分離膠體系配制（凝膠板厚度0.75mm，長度10cm）100ml體系：雙蒸水37.5ml 尿 素20--50g 10×TBE緩沖液8ml 30%丙烯酰胺10ml AP（過硫酸銨）500--800ul [注：現(xiàn)配現(xiàn)用] TEMED（四甲基乙二胺） 23.5ul |
10樓2012-12-06 15:09:37
cicelyzh
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2樓2012-11-19 05:27:58
porphybaby
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膠凝結(jié)的時(shí)間大概是30-40分鐘。好像是要比平時(shí)稍微慢一點(diǎn)。 丙烯酰胺母液是直接買的碧云天的。TEMED那些都是有效的。之前都一直會出現(xiàn)這種情況。 只是有時(shí)候 它出現(xiàn)的位置在靠膠的下方，跑的時(shí)候只要不去到那個(gè)區(qū)域就沒事。但是有時(shí)候它會出現(xiàn)在膠的中部。尤其是它好像是左邊一大坨凝結(jié)了，右邊一大坨也凝結(jié)了，之后中間 就會 形成 一片區(qū)域 是 明顯跟旁邊不一樣的，雖然都是透明，但就會留下條紋，如果把膠拿出來，可以發(fā)現(xiàn)其實(shí)它們的厚度啊啥的有一定的區(qū)別，因此就會出現(xiàn)那種 條紋狀 的 “脊” 請問應(yīng)該怎么克服 |
3樓2012-11-19 09:32:03
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4樓2012-11-19 13:52:32
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5樓2012-11-19 18:14:26
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7樓2012-12-06 11:17:55
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8樓2012-12-06 14:42:33
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