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我想從青霉里面克隆菊粉酶基因，之前退火在42度的時候做出來過，但是覺得條帶淺沒有回收，但是不知道為什么后來重復(fù)了幾百組實(shí)驗(yàn)都沒有在做出來過。引物的Tm值是51.65，我從40到60度來來回回的試了很多遍了。為什么會做不出來了呢？麻煩大家江湖急救一下，給的指導(dǎo)吧。

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1樓 2012-11-28 22:35:18

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可能是模板問題，不純或者是降解了也可能是引物降解了，如果重新制備模板和稀釋引物后還p不出來，建議嘗試降落pcr

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2樓2012-11-29 00:23:34

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再就是增加循環(huán)數(shù)，用好的酶

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3樓2012-11-29 05:06:16

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這種情況，果斷重新設(shè)計(jì)引物。類似情況多次發(fā)生在我們實(shí)驗(yàn)室，引物不夠特異或質(zhì)量不好很容易造成這種情況

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4樓2012-11-29 08:54:21

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別摸；了，就是引物不好使唄，重新設(shè)計(jì)引物

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5樓2012-11-29 11:09:33

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2樓: Originally posted by catmihzh at 2012-11-29 00:23:34
可能是模板問題，不純或者是降解了也可能是引物降解了，如果重新制備模板和稀釋引物后還p不出來，建議嘗試降落pcr

我也懷疑引物被降解或污染了，所以我重新合成的引物，依舊沒有做出來。我提的基因組濃度蠻高的，最近我又跑電泳試了一下，是有一點(diǎn)降解。我現(xiàn)在嘗試稀釋一百倍后的效果，不知道會怎樣。我沒有做過降落pcr，能不能麻煩你給我說一下降落pcr具體步驟，麻煩你了。。。

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6樓2012-11-29 17:57:04

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3樓: Originally posted by bloodwar at 2012-11-29 05:06:16
再就是增加循環(huán)數(shù)，用好的酶

我用的takara的酶，應(yīng)該還過去的吧？！我現(xiàn)在沒有p出條帶來，增加循環(huán)會好使嗎？

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7樓2012-11-29 17:59:15

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4樓: Originally posted by chenguestc at 2012-11-29 08:54:21
這種情況，果斷重新設(shè)計(jì)引物。類似情況多次發(fā)生在我們實(shí)驗(yàn)室，引物不夠特異或質(zhì)量不好很容易造成這種情況

我也懷疑是引物問題。但是我是從一個罕見的青霉中克隆基因的，目前都沒有對這種青霉官方命名，更沒有確定的序列，是通過篩選和測酶活確定產(chǎn)酶的。這種情況下設(shè)計(jì)引物，幾乎等于從未知序列中提取未知基因，師兄從基因庫里找的的青霉屬的菊粉酶基因設(shè)計(jì)的一對引物，計(jì)劃p出1500左右的片段。好有壓力啊。。。。

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8樓2012-11-29 18:06:47

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5樓: Originally posted by sunlk at 2012-11-29 11:09:33
別摸；了，就是引物不好使唄，重新設(shè)計(jì)引物

我是從一個罕見的青霉中克隆基因的，目前都沒有對這種青霉官方命名，更沒有確定的序列，是通過篩選和測酶活確定產(chǎn)酶的。這種情況下設(shè)計(jì)引物，幾乎等于從未知序列中提取未知基因，有什么好的建議嗎？

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9樓2012-11-29 18:09:41

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9樓: Originally posted by Cllair at 2012-11-29 18:09:41
我是從一個罕見的青霉中克隆基因的，目前都沒有對這種青霉官方命名，更沒有確定的序列，是通過篩選和測酶活確定產(chǎn)酶的。這種情況下設(shè)計(jì)引物，幾乎等于從未知序列中提取未知基因，有什么好的建議嗎？...

blast搜索下，看看有沒有同源序列

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10樓2012-11-29 19:30:02

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